(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210845785.7 (22)申请日 2022.07.19 (71)申请人 中国医学 科学院阜外医院 地址 100037 北京市西城区北礼士 路167号 (72)发明人 周洲　王恺隽　高小晶　张伟　 丛洪瀛　 (74)专利代理 机构 北京三友知识产权代理有限 公司 11127 专利代理师 韩蕾　姚亮 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/34(2006.01) G01N 30/60(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 一种基于液相色谱串联质谱技术检测血液 中植物固醇类物质含量的方法 (57)摘要 本发明提供了一种基于液相色谱串联质谱 技术检测血液中植物固醇类物质含量的方法， 所 述植物固醇类物质包括7 ‑烯胆烷醇， 该方法包括 如下步骤： （1） 对血液样本进行前处理， 得到含有 内标物的待测样品； （2） 配制含有内标物的标准 曲线工作， 采用液相色谱串 联质谱分析仪对 标准 曲线工作液和所述待测样品进行上机检测， 根据 拟合的标准曲线方程和待测物峰面积， 采用内标 法计算得出植物固醇类物质的含量。 本发明的检 测方法可有效分离7 ‑烯胆烷醇与胆固醇的色谱 峰， 避免样本中高浓度胆固醇对定量的影响， 扩 展待测植物固醇类物质的线性范围， 并缩短检测 时间。 权利要求书1页 说明书8页 附图5页 CN 114942292 A 2022.08.26 CN 114942292 A 1.一种基于液相色谱串联质谱技术检测血液中植物固醇类物质含量的方法， 所述植物 固醇类物质包括7 ‑烯胆烷醇， 该 方法包括如下步骤： （1） 对血 液样本进行 前处理， 得到含有内标物的待测样品； （2） 配制含有内标物的标准曲线工作液； （3） 采用液相色谱串联质谱分析仪对标准曲线工作液和所述待测样品进行上机检测， 根据标准曲线工作液的检测结果拟合得到标准物浓度和标准物峰面积与内标物峰面积之 比之间的标准 曲线方程， 根据该标准 曲线方程和待测物峰面积， 由内标法计算得出植物固 醇类物质的含量； 其中， 以流动相A和B对色谱柱进行等度洗脱， 流动相A由质量比为82:18:0.1的乙腈、 水 和甲酸组成， 流动相B为无 水乙醇； 色谱时间记为t， 洗脱程序如下： 0min<t≤14mi n时， 通入流动相A， 流速为0.7  mL/min； 14min<t≤15.80mi n时， 通入流速相B， 流速为0.3 5 mL/min； 15.80min<t≤16.81mi n时， 通入流动相A， 流速为0.3 5 mL/min； 16.81min<t≤17.5mi n时， 通入流动相A， 流速为0.7  mL/min。 2.根据权利要求1所述的方法， 其中， 所述色谱柱为C18色谱柱， 柱温为27℃。 3.根据权利要求1所述的方法， 其中， 质谱条件 包括： 气帘气： 3 5psi； 碰撞气： 4un it； GAS1： 40psi； GAS2： 6 0psi； 离子源： 大气压化学电离源； 离 子源温度： 45 0℃； 电离模式： 阳离 子模式。 4.根据权利要求1所述的方法， 其中， 所述植物固醇类物质还包括脱氢胆固醇、 菜油固 醇、 豆固醇、 β ‑谷固醇、 胆甾烷醇中的至少一种。 5.根据权利要求1所述的方法， 其中， 所述血 液样本中还 含有胆固醇。 6.根据权利要求5所述的方法， 其中， 所述胆 固醇与植物固醇类物质总量的浓度比至少 为100： 1。 7.根据权利要求1所述的方法， 其中， 所述内标物为同位素内标物。 8.根据权利要求1所述的方法， 其中， 血 液样品的前处 理包括如下步骤： 离心所述血液样本， 将所得血清、 内标物与无水乙醇混匀， 得到混合物， 然后进行二次 提取， 得到所述待测样品； 所述二次提取包括： 加入水和正己烷并混匀， 取上清液并吹干， 复溶于异丙醇和乙腈的 混合液中。 9.根据权利要求8所述的方法， 其中， 血液样品的前处理还包括： 在二 次提取之前， 对所 述混合物进行皂化处 理； 所述皂化处理包括： 向所述混合物加入10mol/L氢氧化钠溶液并在超声辅助下进行皂 化反应， 反应温度为68℃， 反应时间为20 ‑60min。 10.根据权利要求1所述的方法， 其中， 液相色谱串联质谱分析仪的机型为AB  SCIEX  4500MD。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114942292 A 2一种基于液相色谱 串联质谱技术检测血液中 植物固醇类物质 含量的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 植物固醇检测技术领域， 具体涉及一种基于液相色谱串联质谱技术检 测血液中植物固醇类物质含量的方法。 背景技术 [0002]固醇类物质是动植物细胞膜的重要组成部分， 包括胆固醇和植物固醇， 这两类物 质结构相似。 众所周知， 胆固醇在临床疾病诊疗中有着重要意义， 而植物固醇类物质与 心血 管疾病的强关联性却了解 甚少。 [0003]植物固醇， 也可称为植物甾醇， 主要包括谷固醇、 豆固醇、 菜油固醇、 胆甾烷醇、 脱 氢胆固醇、 7 ‑烯胆烷醇。 1974年首次报道了一对双胞胎姐妹血液中含有高浓度谷固醇、 菜油 固醇， 导致早发冠脉粥样硬化、 关节黄色瘤等， 此种疾病是由于ABCG5和/或ABCG8基因突变 所致， 导致体内植物固醇的吸收后返排受阻， 血液中植物固醇类物质浓度升高， 而植物固醇 类物质水平升高可渗入细胞膜使膜流动性、 通透性降低并导致脂质代谢障碍； 此外， 植物固 醇比胆固醇更易氧化， 其氧化产物严重破坏 内皮细胞并渗透动脉壁， 刺激单核细胞进入组 织分化成巨噬细胞， 最终演变为泡沫细胞引发粥样硬化。 含有谷固醇的脂蛋白可加速巨噬 细胞死亡和斑块坏死， 是冠状动脉斑块破裂和血栓形成的重要原因。 由于植物固醇一定程 度上可竞争性抑制胆固醇吸收， 一般的胆固醇升高所致粥样硬化多建议降低胆固醇合成、 服用一定量 植物固醇含量高的食物， 而对于植物固醇升高的患者， 上述方法可能适得其反。 [0004]植物固醇和胆固醇结构相似， 均以环戊烷多氢菲为基本结构并含有羟基。 现有常 规生化酶法检测胆固醇主要 是通过识别C5、 C6上的双链和3羟基， 然而植物固醇也存在着部 分结构， 因此不能单独区分检测植物固醇和胆固醇。 正常情况下， 植物固醇占整体检测值的 比例很低， 对结果影响不大， 但对于植物固醇血症患者， 血液中植物固醇含量可能是正常的 几十倍， 常规检测方法可能导致误判， 对于因植物固醇过量所致的血管损伤无法判断， 可能 导致错误治疗造成不良预后。 此外， 植物固醇血症患者总胆固醇正常或轻度升高即易早发 冠心病、 血液系统异常等， 对自身及家庭造成巨大负担， 可能提示植物固醇类物质较胆固醇 有更强的致动脉粥样硬化作用， 因此对植物固醇的关注点不应该局限于植物固醇血症， 而 是动脉粥样硬化人群。 [0005]植物固醇和胆固醇的肠道吸收和分泌机制类似， 植物固醇可作为评估肠道胆固醇 吸收和合成的替代标志物， 如脱氢胆固醇、 7 ‑烯胆烷醇代表合成， 谷固醇、 豆固醇、 菜油固 醇、 胆甾烷醇代表吸收。 胆固醇稳态紊乱可与高胆固醇血症、 粥样硬化、 肥胖、 代谢综合征、 糖尿病有关， 一种精准的植物固醇组分检测技术可以帮助评估体内胆固醇的吸收合成平 衡， 更好的指导临床降脂治疗。 [0006]随着对植物固醇类物质的深入了解， 部分研究尝试开发相关检测方法， 目前报道 多用的方法包括气相色谱串联质谱法、 气相色谱串联火焰电离检测器法、 液相色谱 ‑紫外检 测器法、 液相色谱 ‑荧光检测器法， 而这些方法多仅存在科研部门， 操作比较繁琐， 需要衍生说　明　书 1/8 页 3 CN 114942292 A 3