ICS 65.020.30 B41 DB 37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 3128.2—2020 Ⅰ群禽腺病毒感染诊断技术 第 2 部分：血 清 4 型Ⅰ群禽腺病毒感染 PCR 和荧光定量 PCR 诊断技术 Diagnostic techniques for fowl adenovirus group I Part 2: Detection method on fowl adenovirus group I serotype 4 by PCR and quantitative real-time PCR 2020-06-08 发布 山东省市场监督管理局 2020-07--08 实施 发 布 DB37/T 3128.2—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1－2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东农业大学。 本标准主要起草人：刁有祥、唐熠、杨晶、王鸿志、陈浩、冯强、张吉、宋存鑫、李伟。 I DB37/T 3128.2—2020 Ⅰ群禽腺病毒感染诊断技术 第 2 部分：血清 4 型Ⅰ群禽腺病毒感 染 PCR 和荧光定量 PCR 诊断技术 1 范围 本标准规定了血清4型Ⅰ群禽腺病毒聚合酶链式反应（PCR）与实时荧光定量PCR（qPCR）检测方法 的范围、规范性引用文件、术语和定义、实验室要求、样品、结果判定等。 本标准所规定的血清4型Ⅰ群禽腺病毒PCR与实时荧光定量PCR检测方法适用于检测鸡组织、分泌物、 排泄物和鸡胚尿囊液及细胞培养液中血清4型Ⅰ群禽腺病毒的核酸，也适用于鸭、鹅及鸭胚、鹅胚尿囊 液血清4型Ⅰ群禽腺病毒核酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 血清4型Ⅰ群禽腺病毒 Fowl adenovirus group I Serotype 4 是引起禽心包积水-肝炎综合征的病原，主要造成3周龄～5周龄家禽突然死亡，并伴随有心包积水 和肝炎。 3.2 实时荧光定量PCR Quantitative Real-time PCR（qPCR） 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结 合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。 4 实验室要求 4.1 环境 4.1.1 实验室符合 GB19489 和 GB/T 27401 要求，实验室必须为生物安全Ⅱ级（BSL-2 级）及以上实验 室。 1 DB37/T 3128.2—2020 4.1.2 从事 PCR 工作的实验室应进行分区，根据条件划分出前处理区、核酸提取区、核酸扩增区、电 泳检测区，形成有效的物理隔离，且为单一流向，不得倒流。特别注意电泳后的琼脂凝胶要及时处理， 避免对实验室造成污染。 4.1.3 生物样品应严格控制对环境的污染，试验结束后应将相关样品收集高压灭菌后，送有资质的医 用垃圾处理公司做处理。 4.2 人员 操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理、细胞培养和分子生物学实验室检测技术培训。 熟悉生物样品处理、细胞培养、以及核酸提取、基因扩增等分子生物学技术，熟悉PCR与qPCR检测结果 的判断方法。 4.3 仪器设备 4.3.1 生物安全柜。 4.3.2 PCR 仪（温度差小于 0.3 ℃）。 4.3.3 台式低温高速离心机（最大转速为 15000 rpm）。 4.3.4 电泳仪。 4.3.5 电泳槽。 4.3.6 紫外凝胶成像仪。 4.3.7 冰箱：2 ℃～8 ℃。 4.3.8 冰柜：-20 ℃。 4.3.9 微量移液器（最大量程分别为 10 μL、20 μL、100 μL、1000 μL），带滤芯的枪头。 4.3.10 电子天平：精度为 0.001 g。 4.3.11 电磁炉或微波炉。 4.3.12 荧光定量 PCR 仪。 4.4 试剂或材料 除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯，水符合GB/T 6682规定的一级水。 4.4.1 DNA 提取试剂盒。 4.4.2 rTaq DNA 聚合酶：5U/μL。 4.4.3 10×PCR 缓冲液。 4.4.4 dNTPs：2.5 mmol/L, 10 mmol/L。 4.4.5 荧光定量 PCR 试剂盒。 4.4.6 1.5%琼脂糖凝胶，见附录 A.1。 4.4.7 1×TAE 缓冲液，见附录 A.2。 4.4.8 溴化乙锭（10 μg/μL），见附录 A.3。 4.4.9 核酸电泳加样缓冲液，见附录 A.4。 4.4.10 DNA 分子量标准，要求在 100 bp～2000 bp 之间，有 5 条以上的指示条带。 4.4.11 阳性对照标准品，已知的血清 4 型Ⅰ群禽腺病毒 SPF 鸡胚尿囊液。 4.4.12 阴性对照标准品，经高压灭菌的超纯水。 2 DB37/T 3128.2—2020 4.4.13 PCR 检测所需引物： ——上游引物 F：5’-CTCTTCGACCTCGTGTCTTACA-3’； ——下游引物 R：5’-TTTACACGGCGTTGCCTGT-3’，扩增片段长度为 568bp，引物浓度为 100 μmol/L。 4.4.14 荧光定量 PCR 检测所需引物： ——上游引物 1983F：5’-CGTCAACTTCAAGTACTC-3’； ——下游引物 2068R：5’-AGAGGATGCTCATGTTAC-3’； ——探针 P：5’FAM-CCTACTCAGATGGAGGCTTCTACC-TAMRA3’，扩增片段长度为 86bp，引物浓度为 100 μmol/L。 5 样品 5.1 样品采集与运输 采集疑似血清4型Ⅰ群禽腺病毒感染死亡家禽的肝脏、脾脏和肾脏等组织样品，进行分别处理或同 时处理；活禽采集泄殖腔拭子。样品置于在密闭容器中冷藏运输，储藏温度不超过4 ℃，时间不超过24 h。 5.2 样品保存 5.2.1 样品应放在含有抗生素的 pH 值 7.0～7.4 的等渗磷酸盐缓冲液（PBS，附录 A.5）内。 5.2.2 抗生素的选择应视当地情况而定，组织和咽喉拭子悬液中应含有青霉素（2000 IU/mL）、链霉 素（2 mg/mL）、庆大霉素（50 μg/mL）和制霉菌素（1000 IU/mL），加入抗生素后 pH 值应调至 7.0～ 7.4。 5.2.3 在室温放置 1 h～2 h 内样品应尽快处理，不能处理的可在 4 ℃存放，不超过 24 h。 5.2.4 组织研磨液和泄殖腔拭子悬液置于-20 ℃低温条件下保存，不超过 2 wk；-70 ℃贮存不超过 30 d。 5.3 样品处理 5.3.1 在生物安全柜中进行样品处理，取 10 g～20 g 样品放入灭菌的研钵中磨碎。 5.3.2 咽喉或泄殖腔拭子，置于 200 μL 含有青霉素（2000 IU/mL）、链霉素（2 mg/mL）、庆大霉素 （50 μg/mL）和制霉菌素（1000 IU/mL）的 pH 值 7.0～7.4 等渗磷酸盐缓冲液中。 5.3.3 研磨充分的组织用含青霉素（2000 IU/mL），链霉素（2 mg/mL）、庆大霉素（50 μg/mL）和制 霉菌素（1000 IU/mL）pH 值 7.0～7.4 的等渗 PBS 溶液配制成 10%～20%（g/mL）的悬液。样品经 8000 r/min 离心 10 min，取上清液作为材料，进行后续试验。 5.4 对照设置 每次检测，用相应的阳性对照标准品或阴性对照标准品，至少设置一个或一个以上的阴性对照和阳 性对照。 5.5 DNA 提取 按照DNA提取试剂盒说明书，提取样品和对照组的DNA。提取的DNA应立即检测，否则应置于-70 ℃ 冻存。 5.6 PCR 反应 5.6.1 PCR 的反应体系 3 DB37/T 3128.2—2020 10×PCR Buffer 2.5 μL, dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，引物F（100 μmol/L）和R（100 μmol/L） 各0.5 μL，模板DNA 3 μL，rTaq DNA聚合酶0.25 μL，加超纯水至25 μL。 5.6.2 PCR 反应条件 94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。 5.6.3 琼脂糖凝胶电泳 PCR反应结束后，取9 μL样品与1 μL核酸电泳加样缓冲液混匀后，与1.0%琼脂糖凝胶中电泳，在位 于凝胶中央的孔加入DNA分子量标准。加样后，按照5 V/cm电压，电泳30 min。电泳后，置于凝胶成像 仪观察，根据分子量标准判断PCR扩增产物大小。 5.7 实时荧光定量 PCR 反应 5.7.1 实时荧光定量 PCR 反应体系 Premix Ex Taq (Probe qPCR) 10 μL，Rox Reference Dye II 0.2 μL，引物1983F（100 μmol/L） 和引物2068R（100 μmol/L）各0.4 μL，探针P（100 μmol/L）0.4 μL，模板DNA 2 μL，加ddH2O至20 μL。 反应液混匀后置于ABI 7500型荧光定量PCR仪进行扩增。 5.7.2 实时荧光定量 PCR 反应条件 95 ℃ 预变性30 s；95 ℃变性5 s，62 ℃ 退火32 s（收集信号），进行40个循环。 6 结果判定 6.1 阳性对照出现相应大小的扩增条带或扩增曲线，且阴性对照无扩增条带或扩增曲线时，判定检测 结果有效。 6.2 血清 4 型Ⅰ群禽腺病毒 PCR 产物大小为 568bp。阳性对照出现 568bp 扩增条带，阴性对照无条带 出现（引物二聚体除外）时试验成立。被检样品出现 568bp 条带为血清 4 型Ⅰ群禽腺病毒阳性，否则为 阴性（附录 B.1）。 6.3 血清 4 型Ⅰ群禽腺病毒荧光定量 PCR 阳性对照出现 S 型扩增曲线，且 Ct 值小于 35，阴性对照无 S 型扩增曲线，且 Ct 值大于 35 时试验成立。被检样品出现 S 型扩增曲线，且 Ct 值小于 35 为血清 4 型Ⅰ 群禽腺病毒阳性，否则为阴性（附录 B.2）。 4 DB37/T 3128.2—2020 AA 附 录 A （规范性附录） 相关试剂的配制 A.1 1.5%琼脂糖凝胶的配制 琼脂糖 1.5 g 0.5×TAE