ICS 65.150 B 50 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 4058—2020 水生动物细菌性病原检测技术规范 Inspection protocol for bacterial pathogens of aquatic animals 2020 - 07 - 09 发布 山东省市场监督管理局 2020 - 08 - 09 实施 发 布 DB37/T 4058—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由山东省渔业标准化委员会（鲁TC03）归口。 本标准起草单位：威海海洋职业学院、山东省渔业技术推广站、中国科学院水生生物研究所、江苏 省渔业技术推广中心、威海市渔业技术推广站。 本标准主要起草人：侯仕营、刘朋、刘晓燕、李爱华、董济军、刘缵延、吴亚锋、马湘君、尹相菡、 刘振华。 I DB37/T 4058—2020 水生动物细菌性病原检测技术规范 1 范围 本标准规定了水生动物细菌性病原（Bacterial pathogens of aquatic animals）检测的试剂与材 料、仪器设备、采样、细菌性病原分离培养和病原菌检测。 本标准适用于山东省水生动物常见细菌性病原检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 SC/T 7014—2006 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7201.1 鱼类细菌病检疫技术规程 第1部分：通用技术 SN/T 2123 出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范 3 试剂与材料 试剂与材料应符合GB 4789.28和附录A的规定。 4 仪器设备 按照SC/T 7201.1的规定执行。 5 采样 5.1 采样用具 应使用无菌采样用具。 5.2 采样数量、个体要求、采集部位 按照SC/T 7014—2006中第6章的规定执行。 5.3 样品运输及保存 按照SN/T 2123的规定执行。 6 细菌性病原分离培养 6.1 分离培养 1 DB37/T 4058—2020 6.1.1 兼性厌氧菌和需氧菌的分离培养 规范取样后，采用稀释倒平板法、涂布平板法、平板划线法等方式，在28 ℃～30 ℃培养24 h；低 温下取样应在15 ℃～18 ℃同步培养24 h。 6.1.2 厌氧菌的分离培养 将处理好的平板置于玻璃干燥器，并在其上方放置连二亚硫酸钠和无水碳酸钠（分别研细均匀，临 用前混合置于一平皿内）各30 g/1 000 mL容积，然后将干燥器盖严，用凡士林密封，在28 ℃～30 ℃培 养24 h；低温下取样则应在15 ℃～18 ℃同步培养24 h。 严格厌氧菌的分离培养应在厌氧工作台中进行。 6.2 纯培养 6.2.1 兼性厌氧菌和需氧菌的纯培养 挑取单菌落，接种于相应培养基上，按照6.1.1的方法培养。 6.2.2 厌氧菌的纯培养 挑取单菌落，接种于相应培养基上，按照6.1.2的方法培养。 6.3 多次纯培养 若经过纯培养后，未能得到形态特征基本一致的单菌落，可进行多次纯培养，直到获得形态特征基 本一致的单菌落，操作步骤应符合6.2的要求。 7 病原菌检测 7.1 病原菌 16S rDNA 序列分析 7.1.1 菌落 PCR 按照附录B执行。 7.1.2 结果判定 7.1.2.1 PCR 结果可靠 DNA Marker标准样品出现清晰的梯度条带，阳性对照可见1472 bp左右DNA条带，且阴性和空白对照 样品无条带出现，则PCR实验结果可靠，可进行样品分析。 7.1.2.2 电泳失败 DNA Marker标准样品未出现条带，则电泳失败，应检查电泳试剂重新进行电泳。 7.1.2.3 检测结果无效 DNA Marker标准样品出现清晰的梯度条带，阳性对照无条带或者DNA条带非1472 bp左右，或者在阴 性对照和空白对照样品中出现了DNA条带，则试验结果无效，应重新进行PCR扩增。 7.1.3 克隆、测序和比对 2 DB37/T 4058—2020 将7.1.2样品扩增条带克隆、测序，序列输入到NCBI网站进行比对，确定细菌的属种。 7.2 病原菌生化特性检测 按照SC/T 7014—2006中的9.4规定执行。 7.3 结果综合判定 需要鉴定病原菌到属依据7.1.3结果进行判定，需要进一步鉴定到种应结合7.2结果进行综合判定。 3 DB37/T 4058—2020 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 TE缓冲液 A.1.1 A液：1 mol/L Tris·HCl(pH8.0) 称取Tris碱6.06 g，加去离子水40 mL溶解，滴加浓HCl约2 mL调pH至8.0，定容至50 mL。 A.1.2 B液：0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 称取Na2EDTA·2H2O 9.31 g，加超纯水35 mL，剧烈搅拌，用约1 g NaOH颗粒调pH至8.0，定容至50 mL （Na2EDTA·2H2O需加入NaOH将pH调至接近8.0时才会溶解）。 A.1.3 TE缓冲液 量取A液5 mL，B液1 mL于烧杯中，加400 mL去离子水混合，调pH至8.0，定容至500 mL。 A.2 1×TAE缓冲液 称取Tris 242.0 g，Na2EDTA·2H2O 37.2 g于1 L烧杯中，加800 mL去离子水充分搅拌溶解，再加入57.1 mL醋酸，充分混匀。最后以去离子水定容至1 000 mL即为50×TAE缓冲液，使用时稀释50倍即可。 4 DB37/T 4058—2020 BB 附 录 B （规范性附录） 菌落 PCR 测定 B.1 制备DNA模板 用无菌牙签挑取单个菌落到0.2 mL PCR管中，加入10 μL无菌1×TE（见附录A.1）缓冲液弹击混匀， 标记，盖紧，100 ℃煮沸5 min，-20 ℃冷冻5 min（循环2次），5 000 r/min离心1 min，取上清液检测DNA 模板浓度，用于后续PCR扩增。当样本量少时也可采用合适的试剂盒制备DNA模板。 B.2 PCR扩增 采用50 μL PCR反应体系：DNA模板浓度范围为0.2 ng/μL～2 ng/μL，（用核酸测定仪测定DNA模 2+ 板浓度，根据浓度值计算模板添加体积），10×PCR Buffer（含Mg 1.5 mM）5 μL，dNTP（10 mM）1 μ L，上游引物（27F）：5′AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3′，下游引物（1492R）：5′TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T 3′（25 μM）各2 μL，Taq酶（2 U/μL）1 μL～2 μL，去离子水补至50 μL，混匀， 稍离心。 反应管置于PCR仪中，首先95 ℃预变性5 min；主循环30次：94 ℃ 30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃ 30 s （时间可根据片段长度调整）；终延伸72 ℃ 10 min，4 ℃保存。 注：不同细菌PCR程序可不同。 B.3 电泳检测 设置阳性样品对照（如大肠杆菌DNA）、阴性样品（如鱼的基因组DNA或细菌质粒DNA）对照、空白 对照（无DNA）。1×TAE（见附录A.2）缓冲液配置含核酸染料的2 %琼脂糖凝胶，PCR扩增产物与6×上 样缓冲液混合，同时以DL2000或同等大小的DNA Marker标准样品为对照。10 V/cm电泳30 min，凝胶成像 系统拍摄电泳结果。 _________________________________ 5