ICS 11.220 B 41 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 4047—2020 猪圆环病毒 3 型聚合酶链式反应检测方法 Detecting porcine circovirus 3 with polymerase chain reaction 2020 - 07 - 09 发布 山东省市场监督管理局 2020 - 08 - 09 实施 发 布 DB37/T 4047—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：李俊、时建立、彭喆、徐绍建、吴晓燕、刘畅、李琛、孙文博、于江、丛晓燕、 韩红、吴家强、杜以军、陈智。 I DB37/T 4047—2020 猪圆环病毒 3 型聚合酶链式反应检测方法 1 范围 本标准规定了猪圆环病毒3型（Porcine Circovirus Type 3，PCV3）的聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）试验方法。 本标准适用于猪圆环病毒3型的快速诊断、检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541—2016 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 原理 聚合酶链反应或多聚酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），又称无细胞克隆技术，是一 种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半 保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，经过25～30个循环 后，理论上可使基因扩增109倍以上。每完成一个循环需2 min～4 min，2 h～3 h就能将待扩目的基因 扩增放大几百万倍。 4 试剂和材料 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 4.12 水：GB/T 6682，一级水。 蛋白酶 K 溶液（20 mg/mL）：配制见附录 A.1。 10 %十二烷基硫酸钠（SDS 溶液，pH7.2）：配制见附录 A.2。 Tris 平衡酚。 三氯甲烷。 无水乙醇。 70 %乙醇：配制见附录 A.3。 0.5×TBE 缓冲液：配制见附录 A.4。 电泳级 1 %琼脂糖：配制见附录 A.5。 DNA 核酸染料。 DNA Marker 2000。 引物： ——P1：5’-TACCACAGAAGGCGCTATGTCG-3’； 1 DB37/T 4047—2020 ——P2：5’-ATCCGCATAAGGGTCGTCTTGC-3’。 5 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 电子天平：感量为 0.001 g。 微量移液器（最大量程分别为 10 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL）。 低温高速离心机。 PCR 仪。 稳流稳压电泳仪。 水平电泳槽。 凝胶成像系统。 6 样品 6.1 样品采集 按NY/T 541—2016无菌采集血清或猪淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等器官组织。 6.2 样品处理 6.2.1 血清直接用于 DNA 提取。 6.2.2 淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等器官组织各 1 g 剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎，用生理盐 水 1:5 倍稀释，取悬液反复冻融 3 次，5 000 g 离心 15 min，取上清液-20 ℃保存备用。 7 操作步骤 7.1 病毒 DNA 的提取 7.1.1 取上清液（或血清）500 μL 加入 10 %SDS 溶液 50 μL、20 mg/mL 蛋白酶 K 溶液 10 μL，于 55 ℃水浴 2 h～3 h。 7.1.2 加入 200 μL Tris 平衡酚，混匀，4 ℃ 12 000 g 离心 15 min 7.1.3 取上清液 500 μL，加入 200 μL Tris 平衡酚和 200 μL 三氯甲烷，4 ℃ 12 000 g 离心 15 min。 7.1.4 取上清液 400 μL，加入 200 μL 三氯甲烷，4 ℃ 12 000 g 离心 15 min。 7.1.5 取上清液 300 μL，加入 2 倍体积的无水乙醇，-20 ℃静置 20 min，4 ℃ 12 000 g 离心 15 min。 7.1.6 弃上清液，加入 1 mL 70 %的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。 7.1.7 加入 20 μL 灭菌一级水溶解沉淀，-20 ℃保存备用。 7.2 聚合酶链式反应（PCR）操作流程 7.2.1 PCR 反应体系配制 按表1中1-7的循序配制。 表1 聚合酶链式反应体系 1 10×反应缓冲液 5.0 μL 2 dNTP 混合液(10 mmol/L) 4.0 μL 2 DB37/T 4047—2020 表 1 聚合酶链式反应体系（续） 3 P1(10 μmol/L) 1.0 μL 4 P2(10 μmol/L) 1.0 μL 5 DNA 4.0 μL 6 TaqDNA 聚合酶(8 U/μL) 1.0 μL 7 灭菌水 补足至总体积 50.0 μL 7.2.2 PCR 程序设定 每次PCR均应设一个阳性对照和阴性对照（用灭菌水作为模板），具体参数见表2。 表2 PCR 反应程序设定 温度 时间 1 94 ℃ 4 min 2 94 ℃ 20 s 3 50 ℃ 30 s 4 72 ℃ 1 min 5 重复步骤 2～4 40 个循环 6 72 ℃ 5 min 7.3 电泳操作 电压100 V电泳40 min，并在凝胶中加入DNA核酸染料，在DNA凝胶成像系统仪下观察并拍照。 8 结果分析和判定 电泳反应结束后，如果阳性对照孔出现330 bp大小条带，阴性对照孔无特异性条带，则试验成立。 在试验成立的条件下，若泳道扩增出大小为330 bp片段判为疑似阳性样品（说明样品中疑似含有猪 圆环病毒3型），将目的条带进行序列测定，经序列分析后确认为阳性样品（说明样品中含有猪圆环病 毒3型），无特异性扩增的泳道判为阴性。 9 试验材料处理 9.1 病料的无害化处理 对确诊为PCV3阳性的病料应采取深埋、焚烧等方法对病料进行无害化处理。 9.2 试验材料处理 对于PCR过程的废弃物应放置于专门处置危险废弃物的容器内，通过高压消毒等处理后达到生物学 安全标准后才能运出实验室处理。 3 DB37/T 4047—2020 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 蛋白酶K溶液(20 mg/mL) 蛋白酶K 灭菌一级水 100 mg 5 mL A.2 10 %十二烷基硫酸钠(SDS溶液，pH7.2) 十二烷基硫酸钠 灭菌一级水 浓盐酸 灭菌一级水 10 g 80 mL 调pH至7.2 加至100 mL A.3 70 %乙醇 无水乙醇 灭菌一级水 70 mL 30 mL A.4 0.5×TBE缓冲液 Tris 108 g Na2EDTA.2H2O 7.44 g 硼酸 55 g 灭菌一级水 1 L，配成10×TBE缓冲液 取10×TBE缓冲液25 mL，加灭菌一级水475 mL，制成0.5倍的工作液。 A.5 电泳级 1 %琼脂糖 琼脂糖 0.5×TBE缓冲液 0.6 g 60 mL _________________________________ 4