(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210972602.8 (22)申请日 2022.08.12 (71)申请人 合肥工业大 学 地址 230009 安徽省合肥市包河区屯溪路 193号 (72)发明人 李沛军　潘琼　朱苗苗　徐宝才　 厉冰玉　肖晴　 (74)专利代理 机构 南京利丰知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 32256 专利代理师 王锋 (51)Int.Cl. C12N 15/75(2006.01) C12N 9/02(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12N 1/06(2006.01)A23L 13/40(2016.01) A23L 5/40(2016.01) C12R 1/44(2006.01) (54)发明名称 基于重组细菌一氧化氮 合酶的肉品发色剂、 方法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种基于重组细菌一氧化氮 合酶的肉品发色剂、 方法及其应用。 所述肉品发 色剂包含重组细菌一氧化氮合酶和凝固酶阴性 葡萄球菌。 所述重组细菌一氧化氮 合酶是通过培 养以重组表达载体转化枯草芽孢杆菌形成的一 氧化氮合 酶重组菌株后获得， 所述重组表达载体 含有一氧化氮 合酶基因。 本发明的重组细菌一氧 化氮合酶具有较高酶活性， 能催 化产生大量一氧 化氮， 并能够有效结合肉制品中的肌红蛋白产生 亚硝基肌红蛋白， 实现较好发色效果， 尤其是在 与凝固酶阴性葡萄球菌共同使用时， 能更有效地 有效地提升肉制品红色泽， 获得与亚硝酸钠相当 的发色效果， 为肉制品的亚硝酸盐发色替代及其 安全性的提高提供了一种极具实际应用意义的 解决方案 。 权利要求书2页 说明书15页 附图1页 CN 115232830 A 2022.10.25 CN 115232830 A 1.一种基于重组细菌一氧化氮合酶的肉品发色剂， 其特征在于包含重组细菌一氧化氮 合酶， 所述重组细菌一氧化氮合酶的制备 方法包括： 提供含有一氧化氮合酶基因的重组表达载体， 所述一氧化氮合酶基因是以枯草芽孢杆 菌168基因 组DNA为模板扩增获得； 以所述重组表达载体转 化枯草芽孢杆菌， 获得一氧化氮合酶重组菌株； 培养所述一氧化氮合酶重组菌株， 之后分离获得 所述重组细菌一氧化氮合酶。 2.根据权利要求1所述的基于重组细菌一氧化氮合酶的肉品发色剂， 其特征在于还包 括凝固酶阴性葡萄球菌 。 3.根据权利要求2所述的基于重组细菌一氧化氮合酶的肉品发色剂， 其特征在于包括 重组细菌一氧化氮合酶粗提液和凝固酶阴性葡萄球菌悬液， 所述重组细菌一氧化氮合酶粗 提液、 凝固酶阴性葡萄球菌悬液分别含有0.1～1.2mg/mL所述重组细菌一氧化氮合酶、 109 ～1010CFU/mL所述凝固酶阴性葡萄球菌； 和/或， 所述凝固酶阴性葡萄球菌包括马胃葡萄球菌、 肉葡萄球菌和小牛葡萄球菌 中的 任意一种或多种的组合。 4.根据权利要求3所述的基于重组细菌一氧化氮合酶的肉品发色剂， 其特征在于， 所述 重组细菌一氧化氮合酶粗 提液的制备 方法包括以下步骤： X1、 挑取所述一氧化氮合酶重组菌单菌落接种至含卡那霉素的LB培养基中， 在36～38 ℃下培养12～14h， 得到 培养液； X2、 将步骤X1得到的培养液接种至含卡那霉素的TB培养基中， 使接种时OD600达到0.08 ～0.12， 在3 6～38℃下培 养24～26h， 之后分离出培 养体系中的菌体； X3、 将步骤X2分离出的菌体用pH值为7.4～7.5、 浓度为15～20mM的磷酸盐缓冲液充分 洗涤后， 再用浓度为18～20mg/mL的溶菌酶溶液重悬， 之后进行破壁处理， 然后分离获得上 清液， 即为所述重组细菌一氧化氮合酶粗 提液。 5.根据权利要求4所述的基于重组细菌一氧化氮合酶的肉品发色剂， 其特征在于， 步骤 X3所述的破壁处理是采用超声破壁， 具体的条件为： 在频率20～25kHz、 功率100～500W下间 隔2～3s工作2 ～3s。 6.根据权利要求3所述的基于重组细菌一氧化氮合酶的肉品发色剂， 其特征在于， 所述 凝固酶阴性葡萄球菌悬 液的制备 方法包括以下步骤： S1、 将凝固酶阴性葡萄球菌 接入SCB培 养基进行培 养， 获得一代菌； S2、 将步骤S1 获得的一代菌 接入新的SCB培 养基中培 养， 获得二代菌； S3、 取步骤S2获得的二代菌 接种至新的SCB培 养基中培 养， 获得三代菌； S4、 从步骤S3最终 获得的三代菌 培养液中分离出菌体； S5、 将步骤S4分离获得的菌体以pH值为7.0～7.2、 浓度为15～20mM的无菌磷酸盐缓冲 液洗涤、 重悬， 获得凝固酶阴性葡萄球菌悬 液。 7.一种基于重组细菌一氧化氮合酶的肉品发色方法， 其特征在于包括： 将权利要求1 ‑6 中任一项 所述的基于重组细菌一氧化氮合酶的肉品发色剂、 肉糜及辅料均匀混合形成调制 肉糜， 之后使所述调制肉糜发酵、 成熟。 8.根据权利要求7所述的基于重组细菌一氧化氮合酶的肉品发色方法， 其特征在于具 体包括： 将所述调制肉糜在温度23～27℃、 湿度84～86％的条件下发酵1～2d， 结束后立即权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115232830 A 2置于温度23～ 27℃、 湿度69 ～71％条件下成熟 7～12d。 9.根据权利要求7 所述的基于 重组细菌一氧化氮合酶的肉品发色方法， 其特 征在于： 所述重组一氧化氮合酶粗 提液的添加量 为3.8～4.2mg/10 0g肉； 和/或， 所述凝固酶阴性葡萄球菌悬 液的接种量 为6.0～7.5l og CFU/g肉； 和/或， 以100重量份的肉糜为基准计算， 所述的辅料包括以下重量份的组分： 0.5～1.0 重量份的L ‑精氨酸、 0.5～5.0 重量份的氯化钠、 0.5～10 重量份的蔗糖。 10.一种肉制品， 其特征在于， 所述肉制品是由权利要求7 ‑9中任一项所述的基于重组 细菌一氧化氮合酶的肉品发色方法制得的。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115232830 A 3