(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210631568.8 (22)申请日 2022.06.07 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114703247 A (43)申请公布日 2022.07.05 (73)专利权人 北京幸福能量 健康科技有限公司 地址 100028 北京市东城区香河园街1号8 号楼、 9号楼、 10号楼 2层230 (72)发明人 张光明　董洪波　赵杰　王颖　 张琦峰　万宏颖　洪伟雄　 (74)专利代理 机构 北京智鸿港知识产权代理事 务所(普通 合伙) 16003 专利代理师 张学府 (51)Int.Cl. C12P 39/00(2006.01)C12P 21/06(2006.01) C12P 21/00(2006.01) C07K 1/107(2006.01) C12N 1/20(2006.01) A23L 33/18(2016.01) A23L 33/165(2016.01) C12R 1/25(2006.01) C12R 1/07(2006.01) C12R 1/01(2006.01) 审查员 刘新蕾 (54)发明名称 一种高吸收率复合蛋白质组合物及其制备 方法和应用 (57)摘要 本发明提出了一种高吸收率复合蛋白质组 合物及其制备方法和应用， 属于蛋白质技术领 域。 将乳清蛋白粉加入磷酸氢二钠 ‑柠檬酸缓冲 溶液， 接种植物乳杆菌、 凝 结芽孢杆菌、 青春双歧 杆菌进行发酵后， 发酵液加入复合蛋白酶酶解， 得到酶水解液进一步经过同步的超声波和臭氧 处理后， 经交联复合酶酶解， 加入金属离子溶液 加热搅拌反应， 制得高吸收率复合蛋白质组合 物。 本发明制得的高吸收率复合蛋白质组合物分 子量适中， 不会引发肝脏首过效应， 具有高吸收 利用率， 同时， 其蛋白质功能丰富， 有明显的抗衰 老、 抗氧化、 促进脂肪燃烧以及促进代谢的作用。 权利要求书2页 说明书13页 CN 114703247 B 2022.08.23 CN 114703247 B 1.一种高吸 收率复合蛋白质组合物的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1.蛋白溶液的制备： 将乳清蛋白粉加入磷酸氢二钠 ‑柠檬酸缓冲溶液中， 得到蛋白溶 液； S2.菌种的活化： 将植物乳杆菌、 凝结芽孢杆菌、 青春双歧杆菌分别接种到无菌MRS液体 培养基中， 活化培养， 离心， 弃去上清液， 洗涤菌体， 经离心弃去上清液， 利用无菌CaCl2的生 理盐水悬浮菌体细胞， 制备静息细胞 悬液； S3.发酵： 将步骤S2制得的植物乳杆菌、 凝结芽孢杆菌、 青春双歧杆菌静息细胞悬液依 次接种到步骤S1制得的蛋白溶 液中， 发酵培 养， 离心， 取 上清液， 得到发酵 液； S4.酶水解： 向步骤S3制得的发酵液加入复合蛋白酶， 酶解反应， 灭酶， 离心， 得到酶水 解液； 所述复合蛋白酶为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的复合物； S5.超声波协同臭氧处理： 将步骤S4制得的酶水解液超声处理， 同时通入臭氧处理， 得 到处理液； S6.酶法弱交联： 向步骤S5制得的处理液中加入苹果酸， 混合均匀后， 加入交联复合酶， 酶解反应， 灭酶， 离心， 得到弱交联蛋白肽溶液； 所述交联复合酶为谷氨酰胺转氨酶和 漆酶 的复合物； S7.金属离子络合： 向步骤S6中制得的弱交联蛋白肽溶液中加入金属离子溶液， 加热搅 拌反应， 冷冻干燥， 得到高吸 收率复合蛋白质组合物。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤S 1中所述乳清蛋白粉选自分离乳 清蛋白粉、 浓缩牛奶蛋白粉、 水解乳清蛋白粉中的至少一种， 其中一种选择为分离乳清蛋白 粉、 浓缩牛奶蛋白粉、 水解乳清蛋白粉的复配混合物， 质量比为5 ‑10:3‑5:2‑5； 所述磷酸氢 二钠‑柠檬酸缓冲溶液的pH值为7.2 ‑8； 所述蛋白粉和磷酸氢二钠 ‑柠檬酸缓冲溶液的固液 比为1： 50‑100g/mL。 3.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤S2中所述活化培养的条件为36 ‑ 40℃， 微氧条件下， 20 ‑50r/min， 培养 18‑24h； 所述微氧条件为氧气浓度为5 ‑10%， CO2浓度为 3‑7%， 余量为氮气， 其中， %为体积百分比； 所述离心转速为3000 ‑5000r/min， 时间为10 ‑ 15min； 所述静息细胞 悬液经过测定其6 00nm下的光密度值OD600为18‑25OD/mL。 4.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤S3中所述植物乳杆菌、 凝结芽孢 杆菌、 青春双歧杆菌的接种量分别为2 ‑4%、 1‑3%和3‑5%； 所述发酵培养条件为36 ‑38℃， 微氧 条件下， 20 ‑50r/min， 培养24 ‑48h； 所述微氧条件为氧气浓度为5 ‑10%， CO2浓度为3‑7%， 余量 为氮气， 其中， %为体积百分比； 所述离心转速为3 000‑5000r/min， 时间为10 ‑15min。 5.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤S4中所述复合蛋白酶为碱性蛋白 酶和木瓜蛋白酶的质量比为3 ‑7： 2‑5； 所述复合蛋白酶和发酵液的固液比为1： 100 ‑200g/ mL； 所述酶解反应的温度为40 ‑50℃， 时间为3 ‑7h； 所述灭酶方法为1000 ‑1500W超声波处理 10‑15min； 步骤S5中所述超声处理条件为100 ‑200W超声波处理， 所述臭氧处理气体流量为 15‑25L/h， 臭氧浓度为3 0‑70mg/L， 处 理时间为2 ‑5s。 6.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤S6 中所述苹果酸和交联复合酶的 质量比为1 ‑2:5‑12； 所述交联复合 酶为谷氨酰胺 转氨酶和漆酶的质量比为2 ‑5:3‑7； 所述酶 解反应的条件为40 ‑50℃， 时间为1 ‑2h， 所述灭酶方法为1000 ‑1500W超声波处理10 ‑15min， 所述离心转速为3000 ‑5000r/min， 时间为10 ‑15min； 步骤S7中所述金属离子溶液中含有铜权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114703247 B 2离子， 锌离子和铁离子， 含量分别为1 ‑3wt%， 2‑4wt%和3‑5wt%； 所述金属离子溶液和弱交联 蛋白肽溶 液的质量比为2 ‑5:10； 所述加热温度为5 5‑60℃， 时间为20 ‑40min。 7.根据权利要求1所述的制备 方法， 其特 征在于， 具体包括以下步骤： S1.蛋白溶液的制 备： 将5‑10重量份分离乳清蛋白粉、 3 ‑5重量份浓缩牛奶蛋白粉、 2 ‑5 重量份水解乳清 蛋白粉混合均匀后， 得到蛋白粉， 加入pH值为7.2 ‑8的磷酸氢二钠 ‑柠檬酸 缓冲溶液中， 得到蛋白溶液； 所述蛋白粉和磷酸氢二钠 ‑柠檬酸缓冲溶液的固液比为1： 50 ‑ 100g/mL； S2.菌种的活化： 将植物乳杆菌、 凝结芽孢杆菌、 青春双歧杆菌分别接种到无菌MRS液体 培养基中， 36 ‑40℃， 微氧条件下， 20 ‑50r/min， 活化培养18 ‑24h， 离心， 弃去上清液， 洗涤菌 体， 经离心弃去上清液， 利用无菌CaCl2的生理盐水悬浮菌体细胞， 制备静息细胞悬液， 所述 静息细胞 悬液经过测定其6 00nm下的光密度值OD600为18‑25OD/mL； S3.发酵： 将步骤S2制得的植物乳杆菌、 凝结芽孢杆菌、 青春双歧杆菌静息细胞悬液依 次接种到步骤S1制得的蛋白溶液中， 接种量分别为2 ‑4%、 1‑3%和3‑5%， 36‑38℃， 微氧条件 下， 20‑50r/min， 发酵培 养24‑48h， 离心， 取 上清液， 得到发酵 液； S4.酶水解： 向步骤S3制得的发酵液加入复合蛋白酶， 所述复合 蛋白酶和发酵液的固液 比为1： 100 ‑200g/mL， 40 ‑50℃酶解反应3 ‑7h， 灭酶， 离心， 得到酶水解液； 所述复合蛋白酶为 碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的复合物； 所述复合蛋白酶为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比 为3‑7： 2‑5； S5.超声波协同臭氧处理： 将步骤S4制得的酶水解液同步100 ‑200W超声波处理和臭氧 处理， 所述气体流 量为15‑25L/h， 臭氧浓度为3 0‑70mg/L， 处 理时间为2 ‑5s， 得到处 理液； S6.酶法弱交联： 向步骤S5制得的处理液中加入1 ‑2重量份苹果酸， 混合均匀后， 加入5 ‑ 12重量份交联复合酶， 40 ‑50℃酶解反应1 ‑2h， 灭酶， 离心， 得到弱交联蛋白肽溶液； 所述交 联复合酶为谷氨酰胺 转氨酶和漆酶的复合物； 所述交联复合酶为谷氨酰胺转氨酶和漆酶的 质量比为2 ‑5:3‑7； S7.金属离子络合： 向10重量份步骤S6中制得的弱交联蛋白肽 溶液中加入2 ‑5重量份金 属离子溶液， 所述金属离子溶液中含有铜离子， 锌离子和铁离子， 含量分别为1 ‑3wt%， 2‑ 4wt%和3‑5wt%， 加热至55 ‑60℃搅拌反应20 ‑40min， 冷冻干燥， 得到高吸收率复合蛋白质组 合物； 所述微氧条件 为氧气浓度为5 ‑10%， CO2浓度为3‑7%， 余量为氮气， 其中， %为体积百分比； 所述离心转速为3000 ‑5000r/min， 时间为10 ‑15min； 所述灭酶方法为1000 ‑1500W超声波处 理10‑15min。 8.一种如权利要求1 ‑7任一项所述的制备 方