ICS 65.020.30 B 51 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 4131—2020 刺参细菌性腐皮综合征调查技术规范 The specification for the survey technology of the bacterial skin ulcer syndrome of Apostichopus japonicus 2020 - 09 - 25 发布 山东省市场监督管理局 2020 - 10 - 25 实施 发 布 DB37/T 4131—2020 前 言 本标准按GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由山东省农业标准化技术委员会渔业标准化分技术委员会(TC 17/SC03)归口。 本标准起草单位：山东省海洋生物研究院。 本标准主要起草人：樊英、许拉、王淑娴、李乐、王晓璐、于晓清、盖春蕾、刁菁、叶海斌、刘洪 军、李天保。 I DB37/T 4131—2020 刺参细菌性腐皮综合征调查技术规范 1 范围 本标准规定了刺参(Apostichopus japonicus)细菌性腐皮综合征(bacterial skin ulcer syndrome) 调查的总体要求，以及最初调查、现场调查、追踪调查各阶段的内容与要求。 本标准适用于山东省刺参细菌性腐皮综合征的流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 11607 渔业水质标准 GB 13078 饲料卫生标准 GB 17378.6 海洋监测规范 第6部分：生物体分析 GB 17378.7 海洋监测规范 第7部分：近海污染生态调查和生物 GB/T 32756 刺参 亲参和苗种 NY 5052 无公害食品 海水养殖用水水质 NY 5070 无公害食品 水产品中渔药残留限量 NY 5071 无公害食品 渔用药物使用准则 SC/T 2037 刺参配合饲料 DB37/T 442 无公害食品 刺参养殖技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 刺参细菌性腐皮综合征 bacterial skin ulcer syndrome of Apostichopus japonicus 由细菌性病原引起的刺参身体收缩僵直、口部肿胀、摇头、排脏、表皮溃烂等一系列复杂表征。 注：该病多发生在秋冬以及早春低温季节，感染率高，危害严重。 4 总体要求 4.1 调查流程 调查流程一般包括： a) 最初调查：由疾病发生地渔业技术服务机构进行的初步调查； b) 现场调查：在最初调查标记为疑似刺参细菌性腐皮综合征后，由上一级渔业技术服务机构进行 的全面调查，诊断疾病情况，提出监测区域划定； 1 DB37/T 4131—2020 c) 追踪调查：在现场调查判定为刺参细菌性腐皮综合征后，由上一级渔业技术服务机构组织有关 专家进行的全面调查，评估疾病风险，提出监测要求及防控建议。 4.2 调查原则 应遵循以下原则开展调查： a) 科学性：以科学信息为基础； b) 全面性：以最初、现场、追踪调查为内容； c) 限制性：以限制条件、不确定因素、成本和效果的平衡为补充。 4.3 调查取证 4.3.1 应有生产档案以及相关照片、录音、录像等视听资料。 4.3.2 应有书面调查表。 4.3.3 应有调查询问记录、查阅资料记录。 4.4 调查报告 应有调查证据为支撑，对原始证明材料做好标识和保存。 5 最初调查 5.1 调查人员接到报告后应立即到达疾病发生地对疾病进行核实。通过观察刺参身体是否出现收缩僵 直、口部肿胀、摇头、排脏，以及表皮溃烂等征状。如出现上述征状，标记为疑似刺参细菌性腐皮综合 征。 5.2 标记为疑似刺参细菌性腐皮综合征后，调查人员应做好采样、送样和留样工作，填写最初调查表(参 见附录 A)，同时报告上一级渔业技术服务机构。 6 现场调查 6.1 最初调查标记为疑似刺参细菌性腐皮综合征后，专业人员立即按照附录 B 的要求对细菌性病原进 行诊断。 6.2 诊断确定刺参细菌性腐皮综合征病原存在，遵循“早发现、早隔离、早治疗”原则，及时将疾病 严重个体拣出后掩埋或无害化处理，无发病或发病轻的个体可用氨基糖苷类抗菌素或土霉素等抗生素进 行药浴和口服。 6.3 专业调查人员应根据调查、诊断、治疗情况，提出处理措施和技术方案，协助疾病发生地做好后 续监测，填写现场调查表（参见附录 C）。 7 追踪调查 7.1 现场调查判定为刺参细菌性腐皮综合征后，上一级渔业技术服务机构应组织专家对疾病情况、可 能来源、感染范围、传播范围及相关的风险进行评估，追踪流出疾病发生地的水生动物及产品流向，做 好溯源调查，提出防控建议。 7.2 专业调查人员填写追踪调查表（参见附录 D）。 7.3 上一级渔业技术服务机构应组织有关专家确定可能受到威胁的区域，提出监测技术方案。技术方 案应符合附录 E 的要求。 2 DB37/T 4131—2020 8 调查报告 8.1 流行病学调查报告： a) 应包括任务来源、监测地点、监测方式和要求、监测时间和对象、监测过程、资料记录及分析、 监测结果及建议； b) 应涉及监测地点现场调查、追踪调查、溯源调查，以及可能发生的公共预警预报。 c) 附件应有佐证和结论。 8.2 流行病学调查报告参见附录 F。 3 DB37/T 4131—2020 AA 附 录 A （资料性附录） 最初调查表 最初调查表参见表A.1。 表A.1 最初调查表 调查来源 调查人员 调查时间 姓名 电话 单位 名称： 负责人姓名： 疾病发生地情况 联系方式： 地址： 周边环境： 水质条件：(温度、盐度、酸碱度、溶氧、氨氮、浮游动植物、微量元素、光照) 饲料条件： 养殖条件情况 设施条件：(育苗池、养殖池、饵料池、供水系统、供热系统、供电系统，包括进排 水管道、底栖环境、附着基等) 其他： 养殖对象状况 体表： 体壁： 体色： 嘴部： 刺参规格： 疾病核实情况 水温： 肉刺状态： 腹部： 运动伸展状况： 发病数量： pH： 溶解氧： 发病率： 死亡率： 典型征状：□急性发病死亡 □体色正常(棕色/淡红色/绿色)或发白 □嘴部肿大或溃烂 □运动异常 □体表溃烂 □体表肉刺完整或异常 □腹部平滑或异常 天气总体状况： 发病期天气状况 温度： 发病范围 近三年疾病 其他： 单个养殖车间/池塘 附近乡镇 □单个养殖场 □跨县、区、市 □附近养殖场 □其他 从轻到重记录： 发生情况 4 DB37/T 4131—2020 表 A.1 最初调查表（续） 防控措施： 防控条件 防控手段： 处理措施： □ 检测实验室 □无害化处理 □ 兽医机构 □ 其他 采样：□是 □ 否 采样情况： 送检：□是 采样、留样情况 □否 送检单位： 送检时间、批次： 留样情况： 留样时间及批次： 留样保存情况： 其他 病情核实结论 记录人签字： 疑似刺参细菌性腐皮综合征： □是 □否 其他： 核实人签字： 单位盖章 年 月 日 5 DB37/T 4131—2020 BB 附 录 B （规范性附录） 刺参细菌性腐皮综合征病原菌诊断 B.1 病原菌分离、纯化 取病灶组织剪碎、无菌研钵研磨，用无菌接种环挑取少许组织，在营养肉汤琼脂培养基上划线分离， 置28 ℃培养1 d～2 d后挑取优势菌落，重复培养3次以获得纯化菌株。记录纯化菌株的形状、大小、颜 色、光泽、隆起形状、粘稠度、透明度、边缘特征等。 B.2 病原菌鉴定 B.2.1 形态学检测 B.2.1.1 将纯培养细菌菌株经革兰氏染色后在光学显微镜下观察，记录菌体形状、大小情况，有无鞭 毛及鞭毛位置和数量，是否产生芽孢及芽孢位置和形状等。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌 系统鉴定手册》 ，从菌落形态上分析病原菌特征。 B.2.1.2 挑取单菌落，用2 %戊二醛电镜固定液固定数分钟，取一滴固定好的菌液置于铜网上，以3 % 磷钨酸负染，晾干，在透射电镜下观察，分析记录病原菌特征。 B.2.2 生理生化检测 将纯培养细菌菌株接种于特定培养物或检测管，通过产酸、产气、颜色变化等反应，检测细菌的生 物化学性质，鉴定细菌的种属；也可借助生化测定试剂盒、细菌分析鉴定仪进行快速测定，并补充其它 的生理生化实验。 B.2.3 病理学检测 通过组织切片法，经取样、固定、脱水、浸蜡、包埋、切片与贴片、染色与封固等技术处理后，进 行病理学显微观察，记录病征组织变化。 B.2.4 分子生物学方法检测 对纯培养细菌菌株进行16S rDNA分析。首先提取纯培养细菌菌株DNA，测定其浓度，保证在60-100 ng/µL 。 以 此 为 模 板 、 利 用 16S 通 用 引 物 (27f: 5 ’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ’ ， 1492r: 5 ’ -TACGGCTACCTTGTTACGA CTT-3’)进行PCR扩增。50 µL的PCR反应体系中含有：PreMix混合物25 µL，浓 度20 µmol/L引物各1 µL，DNA模板1 µL，加蒸馏水至50 µL体积。PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min，1 次；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 40 s，30个循环；最后72 ℃温育6 min。PCR产物通过测序获 得序列结果，将结果上传NCBI GenBank数据库进行Blast比对，选择同源性较高的细菌进行系统发育分 析，确定纯培养细菌菌株种属关系。 B.3 病原菌的致病性确定 6 DB37/T 4131—2020 将疑似刺参细菌性腐皮综合征病原菌分离纯化，获得纯培养菌株后，在健康刺参正常养殖状态下进 行疑似病原菌人工回感染实验，观察刺参感染后的情况是否与刺参细菌性腐皮综合征表述相符，同时再 次分离、纯化病原菌，通过形态学、生理生化、病理学和16S rDNA分子生物学验证是否一致，若与原疑 似刺参细菌性腐皮综合征病原菌特性一致，即认为是细菌性腐皮综合征致病菌。 B.4 编制诊断报告 诊断完成后应编制诊断报告。诊断报告参见表B.1。 表B.1 刺参细菌性腐皮综合征病原诊断报告 委托单位名称 委托单位地址 样品名称 检测类别 生产单位名称 检测项目 样品编号 样品规格 样品数量 样品状态 检测时间 检测环境条件 检测依据 所用主要仪器 抽样信息 抽样编号 抽样基数 抽样日期 抽样数量 抽样地点 抽样方法 形态学特 征 检测结论