ICS 65.020.30 B 41 DB12 天 津 市 地 方 标 准 DB12/T 987—2020 鲜、冻畜禽肉中磺胺类、喹诺酮类和四环素 类兽药残留量的测定 液相色谱-串联质谱 法 Determination of residues of sulfonamides, quinolones and tetracyclines in fresh and frozen meat of livestock and poultry by liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2020 - 10 - 14 发布 天津市市场监督管理委员会 2020 - 11 - 15 实施 发 布 DB12/T 987—2020 前 言 本标准依据GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。 本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、摩天众创（天津）检测服务有限公司。 本标准主要起草人：李娜、林宏芳、邵辉、李辉、刘磊、张玉婷、郭永泽、绳慧珊、卢娜、冯兆欣、 郝玉杰、潘喆。 I DB12/T 987—2020 鲜、冻畜禽肉中磺胺类、喹诺酮类和四环素类兽药残留量的测定 液 相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准规定了鲜、冻畜禽肉中磺胺类、喹诺酮类和四环素类兽药残留量的测定-液相色谱-串联质谱 法的方法提要、试剂和材料、仪器和设备、试样制备与保存、测定步骤、灵敏度、准确度和精密度。 本标准适用于鲜、冻畜禽肉中磺胺类、喹诺酮类和四环素类共28种兽药残留的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法提要 试样经酸化乙腈提取，提取液浓缩、甲醇定容后，用液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）测定，基 质外标法定量。 4 试剂和材料 4.1 基本要求 除另有说明外，所用试剂均为分析纯。所用水为GB/T 6682规定的一级水。 4.2 试剂 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.2.5 4.2.6 4.2.7 4.2.8 4.2.9 4.2.10 乙腈：色谱纯。 甲醇：色谱纯。 甲酸：色谱纯。 乙酸：色谱纯。 正己烷。 无水硫酸钠。 乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA•2H2O）。 柠檬酸（C6H8O7•H2O）。 磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O） 氢氧化钠（NaOH）。 4.3 溶液配制 1 DB12/T 987—2020 4.3.1 氢氧化钠溶液（1 mol/L）：称取 4.0 g 氢氧化钠，用水溶解并定容至 100 mL。 4.3.2 氢氧化钠溶液（0.03 mol/L）：称取 0.12 g 氢氧化钠，用水溶解并定容至 100 mL。 4.3.3 Na2EDTA-McIlvaine 缓冲溶液（0.1 mol/L）：称取 12.9 g 柠檬酸，10.9 g 磷酸氢二钠，37.2 g 乙二胺四乙酸二钠，加 900 mL 水溶解，用 1 mol/L 氢氧化钠溶液调 pH 值至 4.0，加水定容至 1000 mL。 4.3.4 0.1%甲酸水：移取 0.1 mL 甲酸加入 100 mL 水中，混匀。 4.3.5 0.1%甲酸甲醇：移取 0.1 mL 甲酸加入 100 mL 甲醇中，混匀。 4.3.6 甲醇-0.1%甲酸（10:90，V:V）：移取 10 mL 甲醇加入 90 mL 0.1%甲酸水溶液中，混匀。 4.4 标准品 磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺 胺甲噻二唑、磺胺氯哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁 啉、麻保沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、二氟沙星、噁喹酸、氟甲喹、土霉素、金霉素、强力 霉素标准品：纯度≥98.0%； 环丙沙星纯度≥95.0%，(达氟)单诺沙星纯度≥94.0%，沙拉沙星纯度≥95.0%， 四环素纯度≥96.5%。 4.5 标准溶液配制 4.5.1 标准储备溶液（1000 mg/L）：准确称取 10 mg 各兽药标准品，根据标准品的溶解性不同，磺胺 类、四环素类兽药用乙腈溶解并定容至 10 mL，喹诺酮类兽药先用 2 mL 氢氧化钠溶液溶解，甲醇定容 至 10 mL，于-18℃避光保存，有效期 1 年。 4.5.2 标准工作溶液：分别吸取 28 种兽药标准储备液 0.25 mL 于 25 mL 容量瓶，用乙腈稀释并定容， 配制成浓度为 10 mg/L 的混合标准工作液，于 4 ℃避光保存，有效期 1 个月。 4.6 材料 4.6.1 十八烷基硅烷键合硅胶（C18）：40~60 μm。 4.6.2 氨基硅烷化硅胶（NH2）：40~60 μm。 4.6.3 微孔滤膜（有机相）：0.22 μm。 5 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 液相色谱-串联质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI）。 分析天平：感量 0.0001 g 和 0.01 g。 台式高速离心机：转速不低于 4000 r/min。 匀浆机。 涡旋混合器。 氮吹仪。 纯水仪。 6 试样制备与保存 6.1 试样制备 鲜、冻畜禽肉类样品剔去毛、淤血、骨等，取缩分后样品，用匀浆机捣碎成肉糜状，混匀，装入清 洁容器内，密封并标识。用冷冻畜禽肉类样品在室温下自然解冻至稍微变软，且冻水未流出待制备。 2 DB12/T 987—2020 6.2 试样保存 试样应在-18 ℃条件下保存。 7 测定步骤 7.1 样品前处理 准确称取试样2.00 g（精确至0.02 g）于50 mL聚丙烯塑料离心管中，加入 2 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine缓冲溶液，3 mL乙腈，涡旋2 min，4000 r/min离心5 min，收集上清液于另一50 mL 离心管中，残渣加5 mL乙腈，涡旋2 min，4000 r/min离心5 min，合并上清液于上述50 mL离心管中。 于上清液中依次加入200 µL乙酸，1 g氯化钠，涡旋1 min，4000 r/min离心5 min，取上层乙腈相2 mL 于10 mL聚丙烯塑料离心管中，加入C18和NH2吸附剂各100 mg，涡旋1 min，4000 r/min离心5 min，取上 清液，氮气吹干。残渣用1 mL 甲醇-0.1%甲酸水（10:90，V:V）定容，过0.22 µm有机滤膜。 7.2 测定 7.2.1 液相色谱条件如下： ——色谱柱：Acquity BEH RP18 柱 (2.1×100 mm，1.7 μm)； ——流动相：A 相：0.1%甲酸甲醇；B 相：0.1%甲酸水；梯度洗脱条件见表 1。 ——进样量：10 μL； ——柱温：30 ℃。 表1 梯度洗脱条件 a a 时间(min) 流速(mL/min) VA(%) VB(%) 曲线 0 0.2 5 95 Initial 3 0.2 20 80 6 7 0.2 40 60 6 10 0.2 40 60 6 11 0.2 90 10 6 12 0.2 90 10 6 14 0.2 5 95 1 表示线性变化，1 表示立即变化。 7.2.2 质谱条件如下： ——电离源：电喷雾正离子 (ESI+)； ——毛细管电压：3.0 kV； ——离子源温度：120 ℃； ——脱溶剂气温度：400 ℃； ——脱溶剂气流量：600 L/h； ——锥孔反吹气流量：60 L/h； ——检测方式：多反应监测（MRM）； 质谱采集参数附录A。 7.3 定性 3 DB12/T 987—2020 液相色谱-串联质谱法对样品定性确证须满足以下要求： ——待测样品的保留时间在外标标准样品的保留时间的±2.5%之内； ——定性离子的信噪比大于 3（S/N>3）； ——与外标标准品相比，样品的两个特征离子相对丰度在表 2 规定的许可范围内。 28种兽药的多反应监测（MRM）色谱图参见附录B。 表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度比（%） 允许的最大偏差（%） ＞50 ±20 ＞20～50 ±25 ＞10～20 ±30 ≤10 ±50 7.4 定量 采用外标法定量。用色谱数据处理软件或按公式（1）计算试样中的目标物含量（µg/kg）：   s  A V 3 V1 .................................. (1)   As V 2 m 式中： ω——试样中目标物的含量，单位为微克每千克（µg/kg）； ρs目标物标准工作溶液的浓度，单位为微克每升（µg/L）； A 试样测定液中目标物定量离子的峰面积； As 标准工作溶液中目标物定量离子的峰面积； V1提取溶液中乙腈的总体积（mL）； V2吸取用来净化的提取溶液的体积（mL） V3最终定容体积（mL）； V 试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）； m 试样溶液所代表试样的量，单位为克（g）； 注：计算结果保留两位有效数字，当结果大于1 µg/kg时保留三位有效数字。 8 灵敏度 28种兽药的检测限在0.5 µg/kg～3.0 µg/kg之间。磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、 磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噻二唑、磺胺氯哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺间甲 氧嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、麻保沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、单诺沙星、 环丙沙星、恩诺沙星、二氟沙星、沙拉沙星、噁喹酸、氟甲喹的定量限为5.0 µg/kg，四环素、土霉素、 金霉素和强力霉素的定量限均为10.0 µg/kg。 9 准确度和精密度 9.1 准确度 4 DB12/T 987—2020 9.1.1 鲜、冻畜禽肉中磺胺类和喹诺酮类兽药在 5 µg/kg～50 µg/kg 添加水平，回收率在 70%～110% 之间； 9.1.2 鲜、冻畜禽肉中四环素类兽药在 10 µg/kg～50 µg/kg 添加水平，回收率在 70%～110%之间。 9.2 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。 5 DB12/T 987—2020 AA 附 录 A （资料性附录） 28 种兽药检测 表A.1 28 种兽药中英文名称、保留时间、质谱检测条件和定量限 名称 磺胺醋酰 Sulfacetamide 磺胺嘧啶 Sulfadia