ICS 65.020.20 DB32 B 31 江 苏 省 地 方 标 准 DB 32/ T 3775—2020 猪繁殖与呼吸综合征病毒 RT-LAMP 检测 方法 RT-LAMP method for Detectiong Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus 2020 - 04 - 08 发布 江苏省市场监督管理局 2020 - 05 - 15 实施 发 布 DB32/T 3775—2020 目 次 前 言 .....................................................................................................................................................Ⅰ 1 范围 ...........................................................................................................................................................1 2 规范性引用文件 .......................................................................................................................................1 3 缩略语 .......................................................................................................................................................1 4 原理 ...........................................................................................................................................................1 5 试剂和仪器设备 .......................................................................................................................................2 6 操作程序 ...................................................................................................................................................2 7 结果判定 ...................................................................................................................................................4 8 安全和防污染措施 ...................................................................................................................................4 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 .................................................................................................5 附 录 B （资料性附录） .......................................................................................................................6 I DB32/T 3775—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由南京农业大学提出并归口。 本标准起草单位：南京农业大学。 本标准主要起草人：姜平、张日腾、白娟、熊富强、王先炜、李玉峰、陈闻。 II DB32/T 3775—2020 猪繁殖与呼吸综合征病毒 RT-LAMP 检测方法 1 范围 本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测原理、试剂和仪器设备、检测程序和结果判 定。 本标准适用于猪临床样品（肺脏、脾脏和血清）和细胞培养物中猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测； 同时适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒经典型、高致病性、类NADC30型三种基因亚型的分型检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 SN/T1193 基因检验实验室技术要求 3 缩略语 PRRSV: porcine reproductive and respiratory syndrome virus，猪繁殖与呼吸综合征病毒 LAMP：loop-mediated isothermal amplification, 环介导的恒温扩增 RT-LAMP：Reverse transcription, loop-mediated isothermal amplification，反转录环介导的恒温扩增。 4 原理 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）主要引起猪繁殖与呼吸综合征 (俗称蓝耳病)。该病毒有美洲 型和欧洲型两个血清型。美洲型又有多个基因亚型。我国流行的美洲型 PRRSV 主要有传统型、高致病 性和类 NADC30 型毒株，其主要区别存在于病毒的 Nsp2 基因。环介导的恒温扩增（LAMP）是一种体 外恒温核酸扩增技术，用于快速检测 DNA。RT-LAMP 是一种逆转录 LAMP，用于检测 RNA。本标准 RT-LAMP，根据 PRRSV 开放阅读框架 7（ORF7）基因序列、ORF1a（非结构蛋白 Nsp2）基因序列设 计 4 组引物，建立 4 种 RT-LAMP 检测方法（即 LAMP1、LAMP2、LAMP3 和 LAMP4)，其中 LAMP1 的特异性引物识别 ORF7 基因，LAMP2、LAMP3 和 LAMP4 的特异性引物识别 Nsp2 基因。每种 LAMP 引物均包括两对内、外引物（内引物 FIP 与 BIP，外引物 F3 与 B3）和一对环引物（LF 与 LB）。利用 Bst 酶启动循环链置换反应，启动互补链合成，通过在同一链上互补序列周而复始形成有很多环状结构 的茎环 DNA 混合物，在恒温条件下完成核酸扩增反应。从 dNTP 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的 Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。 该检测方法简便快速、敏感特异，不需要昂贵的仪器设备。 1 DB32/T 3775—2020 5 试剂和仪器设备 5.1 试剂要求 除有特殊说明外，所有生化试剂均为分析纯。RNA提取相关试剂或用品均需经无RNA酶处理。 5.2 引物 PRRSV LAMP检测引物和PRRSV毒株基因亚型鉴别LAMP引物，人工合成（基因序列见附录B.1）。 5.3 通用试剂 裂解液（TRIZOL） ；氯仿；0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2） （见附录A.1） ；DEPC处理水（见 附录A.2） ；异丙醇；75%乙醇；耐热M-MLV（RNase H-）反转录酶；pMD18-T载体；胶回收试剂盒（Qiagen）； 质粒DNA提取试剂盒（TaKaRa） ；PCR试剂（Promega） 。 5.4 LAMP 试剂 ——10×Bst DNA 聚合酶缓冲液（见附录 A.3）； ——100 mmol/L MgSO4； ——10 mmol/L dNTPs （dATP,dCTP ,dTTP,dGTP)； ——8 U/µL Bst DNA 聚合酶； ——5 mol/L 甜菜碱（Betaine）； ——灭菌双蒸水。 ——SYBR Green I 染料，1000×。 5.5 阴性及阳性对照 5.5.1 阴性对照 pMD18-T空载体质粒。 5.5.2 阳性对照 LAMP1阳性对照为pMD-BB-N质粒（含高致病性PRRSV BB0907毒株ORF7基因）；LAMP2阳性对 照为pMD-S1-Nsp2质粒（含传统型PRRSV S1毒株Nsp2基因） ；LAMP3阳性对照为pMD-BB-Nsp2质粒（含 高致病性PRRSV BB0907毒株Nsp2基因） ；LAMP4阳性对照为pMD-FJ-Nsp2 质粒（含类NADC30 PRRSV FJ1402毒株Nsp2基因） 。 5.6 仪器 高速冷冻离心机，恒温水浴锅，微量移液器（0.5 μL～10 μL、20 μL～200 μL、100 μL～1 000 μL）， PCR 仪，EP 反应管（0.5 mL、1.5 mL），组织匀浆器或研钵。 6 检测程序 6.1 样品处理 按照NY/T 541动物疫病实验室检验采样方法，采集待检猪的肺脏、脾脏和血清等样品。肺脏、脾 脏取约1g，剪碎后按1:3（V/V）加入PBS（0.01mol/L，pH7.2） ，充分匀浆呈悬液。血清制备方法为：血 2 DB32/T 3775—2020 液（不加抗凝剂）室温静置2 h ~3 h后，4000 r/min离心5 min，取上清液置于EP管内。处理好的匀浆悬 液和血清于-20 ℃保存备用。 样品 RNA 制备按照经验证的 RNA 提取方法或等效的商品化 RNA 提取试剂盒，按照其使用说明操 作。提取的 RNA 应在 2 h 内进行反转录或放置于-20℃保存备用。 6.2 反转录（cDNA 的合成） 配制反转录反应体系 19 µL，含 M-MLV 5×Reaction buffer（含 Mg2+） 4 µL；2.5 mol