(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210149832.4 (22)申请日 2022.02.18 (71)申请人 天津科技大 学 地址 300457 天津市滨 海新区经济技 术开 发区第十三大街9号 (72)发明人 马龙　庄建文　满淑丽　叶盛英　 刘国珍　殷利眷　 (74)专利代理 机构 重庆市嘉允启行专利代理事 务所(普通 合伙) 50243 专利代理师 胡柯 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01)C12R 1/42(2006.01) (54)发明名称 基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸 分析装置 检测病原菌的方法及应用 (57)摘要 本发明公开了一种基于SERS的CRISPR/Cas 系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法 及其应用， 所述方法该只需提取出样品中病原菌 的基因组， 进行RPA等温扩增后即可通过CRISPR/ Cas系统在μPAD上与夹心金纳米星探针结合反 应， 实现对微生物致病菌沙门氏菌的检测， 检测 范围较宽， 方法简单 快捷， 易操作。 权利要求书2页 说明书10页 附图12页 CN 115404279 A 2022.11.29 CN 115404279 A 1.一种基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法， 其特征 在于， 所述方法包括有以下步骤： 1)提取病原菌基因 组并进行RPA等温扩增， 得到待测基因 组； 2)将夹心金纳米星探针加到 μPAD分析装置的加载区域中进行干燥； 3)将步骤1)中 的待测基因组加入到CRISPR/Cas系统中进行反应， 得到CRISPR/Cas反应 体系； 4)将步骤3)中的CRISPR/Cas反应体系加到步骤2)中干燥有夹心金纳米星探针的μPAD 分析装置中进行反应， 并在 μPAD分析装置的检测区域内形成检测点； 5)采用手持拉曼仪对步骤4)中 μPAD分析装置的检测区域进行拉曼检测。 2.根据权利 要求1所述的一种基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测 病原菌的方法， 其特 征在于， 所述夹心金纳米星探针的制备 方法包括有以下步骤： 前期准备： 将制备过程中所用到的玻璃器皿都需要在王水(HNO3： HCl＝3:1)中浸泡 30min以上， 然后用超纯 水冲洗； 制备纳米星种子： 利用种子培养法， 将HAuCl4溶液加热直至沸腾后迅速向沸腾溶液中加 入二水柠檬酸 三钠溶液， 不断搅拌溶 液从浅黄色逐渐 变成酒红色， 得到纳米星种子溶 液； 制备夹心金纳米星： 在离心管中加 入超纯水、 HAuCl4、 HCl， 然后加入制备好的纳米星种 子溶液， 搅拌均匀 后， 迅速加入硝酸银溶液和抗坏血酸溶液， 振荡30 s后， 溶液迅速由淡红色 转化成黑绿色， 然后加入十二烷基硫酸钠溶液， 搅拌混匀， 离心， 弃掉上清， 用超纯水重悬， 得到金纳米星溶液AuNSs， 加入4 ‑MBA， 于37℃孵育2h， 加入CTAC、 HAuCl4、 AA， 搅拌混匀， 离 心， 弃掉上清， 用超纯 水重悬后， 得到 夹心金纳米星溶 液AuNS@4 ‑MBA@Au； 将一端修饰巯基SH ‑的两条单链DNA干粉， 即DNA1和DNA2， 加入ddH2O， 配制成含DNA1和 DNA2溶液； 取含DNA1和DNA2溶液加入到AuNS@4 ‑MBA@Au溶液中， 振荡混匀后在 ‑20℃条件下冷冻结 合， 解冻后离心， 弃掉上清， 用缓冲液HEP ES重复离心洗脱3次， 然后重悬， 得到结合好的夹心 金纳米星探针即AuNS@4 ‑MBA@Au@DNA探针。 3.根据权利 要求2所述的一种基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测 病原菌的方法， 其特 征在于， 所述两条SH ‑DNA的序列分别如下 所示： DNA1： SH‑AAAAAAAAACCCAGGTTCTCT‑3’； DNA2： 5’ ‑TCACAGATGCGTA AAAAAAAA‑SH。 4.根据权利 要求1所述的一种基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测 病原菌的方法， 其特 征在于， 所述 μPAD分析装置的构建方法具体步骤如下： 先用蜡打印机在纤维素滤纸上将蜡打印出来， 制作为墙壁和蜡阀， 然后在120摄氏度的 温度下用热板加热90秒， 让熔化的蜡渗透到纤维素滤纸上， 蜡 堵微孔形成疏水屏障， 蜡阀将 μPAD分割为加载区域和检测区域， 将1 ×2.2cm的胶条粘贴在装置背面作为后垫， 以保留溶 液， 即构建得到 μPAD分析装置 。 5.根据权利 要求1所述的一种基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测 病原菌的方法， 其特 征在于， 所述CRIS PR/Cas系统选自CRIS PR‑Cas12a系统。 6.根据权利 要求1所述的一种基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测 病原菌的方法， 其特 征在于， 所述病原菌为鼠伤沙门氏菌 。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115404279 A 27.根据权利 要求1所述的一种基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测 病原菌的方法在制备微 生物检测试剂中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115404279 A 3