ICS 11.220 B 41 吉 DB22 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 3172.4—2020 流感病毒 HA 和 NA 基因荧光 RT-PCR 检测 第 4 部分：H7N7 亚型马流感病毒 Real-time RT-PCR detection on HA and NA genes of influenza virus Part 4: H7N7 subtype equine influenza virus 2020 - 10 - 14 发布 吉林省市场监督管理厅 2020 - 10 - 30 实施 发 布 DB22/T 3172.4—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。 DB22/T 3172《流感病毒HA和NA基因检测 荧光RT-PCR法》分为四个部分。 ——第 1 部分：H7N9亚型禽流感病毒； ——第 2 部分：H7N4亚型禽流感病毒； ——第 3 部分：H3N8亚型马流感病毒； ——第 4 部分：H7N7亚型马流感病毒。 本部分为DB22/T 3172的第 4 部分。 本部分由长春海关提出并归口。 本部分起草单位：长春海关技术中心。 本部分主要起草人：王伟利、王准、王玮琳、姚贵哲、刘金华、肖芳、李玥、马文晨、杨帆、蔡阳、 马玲。 I DB22/ 3172.4—2020 流感病毒 HA 和 NA 基因荧光 RT-PCR 检测 第 4 部分：H7N7 亚型马流感病毒 1 范围 本标准规定了H7N7亚型马流感病毒HA和NA基因荧光RT-PCR检测方法的原理、试验条件、试剂与材料、 仪器设备、样品、试验步骤和试验数据处理及试验报告。 本标准适用于H7N7亚型马流感病毒检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值：每个反应管内的荧光信号达到的设定的阈值时所经历的循环数（Cycle threshold） DEPC：焦磷酸乙二酯（Diethy pyrocarbonate） HA：血凝素（Hemagglutinin） NA：神经氨酸酶（Neuraminidase） RNA：核糖核酸（Ribonucleic Acid） RT-PCR：反转录聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction） Taq 酶：Taq 脱氧核糖核酸聚合酶（Thermusaquaticus DNA polymerase） 4 原理 根据H7N7亚型马流感病毒HA基因和NA基因序列设计特异引物和探针，探针结合部位在扩增片段内 部。HA基因和NA基因探针分别在5’端标记FAM和VIC荧光素作为报告荧光基团，3’端分别标记TAMRA和MGB 作为淬灭荧光基团。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上荧光基团 发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥 5’→3’的外切核酸酶功能，将探针降解，探针上的荧光基团游离出来，所发出的荧光不再为淬灭基团所 吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。据 此荧光PCR仪可实现对HA基因和NA基因的同步实时检测。 5 试验条件 1 DB22/ 3172.4—2020 5.1 生物安全措施 所有培养物和废弃物的处置应按照GB 19489中的有关规定执行。 5.2 防污染措施 防止污染措施应符合GB/T 27401的规定。 6 试剂与材料 6.1 试剂 6.1.1 6.1.2 6.1.3 6.1.4 6.1.5 6.1.6 6.1.7 阴性对照：可采用经灭活的不含马流感病毒的鸡胚尿囊液。 阳性对照：非感染性体外转录 RNA，-20 ℃保存备用。 2×RT-PCR Buffer。 RT Enzyme Mix。 Taq 酶。 DEPC 水：0.1% DEPC 处理后的去离子水。 引物与探针：见表 1。 表1 HA 基因 NA 基因 6.2 引物 F1 5’– AAAATAGAATACAGATAGACCCTGT–3’ 引物 R1 5’– GTGCACGGCATGTTTCC–3 探针 P1 FAM– CTTCGGGGCATCATGTTTTCTTCTTCTTG–TAMRA 引物 F2 5’ – AACTGGCAGGGAGCAAATAGG–3’ 引物 R2 5’ – TGCTGGTGTCTGTGAGAATTCC–3’ 探针 P2 VIC– TATGAACACATTGGAGCACAC–MGB 材料 6.2.1 6.2.2 7 H7N7 亚型马流感病毒 HA 基因和 NA 基因引物和探针 离心管（1.5 mL、0.2 mL）。 荧光 PCR 反应管（0.1 mL、0.2 mL）。 仪器设备 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 8 生物安全柜。 高速冷冻离心机（13 000 r/min）。 微量可调移液器 (2.5µL、10 µL、100 µL、1 000 µL)。 超低温冰箱（-80 ℃）。 荧光定量 PCR 仪（至少包含 FAM 和 VIC 通道）。 旋涡振荡器。 高压灭菌器。 样品 2 DB22/ 3172.4—2020 8.1 采集 将拭子经前侧鼻道伸入鼻腔深部蘸取呼吸道黏液，取出后立即放入盛有2.0 mL PBS液（含有青霉素 和链霉素）的采样管中，编号。 8.2 运输与储存 鼻拭子样品在2 ℃～8 ℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，应放置-70 ℃冰箱中，但应避 免反复冻融。 9 试验步骤 9.1 核酸提取 采用市售RNA提取试剂盒或自动化核酸提取仪及配套核酸提取试剂进行提取。 9.2 9.2.1 荧光 RT-PCR 检测 反应体系 在PCR溶液配制区，反应体系配制见表2与表3，每份检测样品的荧光RT-PCR体系为25 µL。用旋涡 振荡器进行混匀，瞬间离心后置荧光PCR仪扩增。 表2 H7N7 亚型马流感病毒 HA 基因荧光 RT-PCR 反应体系 成分 2×RT-PCR Buffer（6.1.3） RT Enzyme Mix 5 U/µL（6.1.4） Taq 酶 5 U/µL（6.1.5） F1 10 µmol/L（6.1.7） R1 10 µmol/L（6.1.7） P1 10 µmol/L（6.1.7） 模板 RNA DEPC水（6.1.6） 总计 表3 用量 µL 12.5 0.5 0.5 1.0 1.0 1.0 5.0 3.5 25 H7N7 亚型马流感病毒 NA 基因荧光 RT-PCR 反应体系 成分 2×RT-PCR Buffer（6.1.3） RT Enzyme Mix 5 U/µL（6.1.4） Taq 酶 5 U/µL（6.1.5） F2 10 µmol/L（6.1.7） R2 10 µmol/L（6.1.7） P2 10 µmol/L（6.1.7） 模板 RNA 用量 µL 12.5 0.5 0.5 1.0 1.0 1.0 5.0 DEPC水（6.1.6） 总计 3.5 25 3 DB22/ 3172.4—2020 9.2.2 反应参数 9.2.2.1 9.2.2.2 9.2.2.3 10 第 1 阶段，反转录 45 ℃ 30 min。 第 2 阶段，预变性 92 ℃ 3 min。 第 3 阶段，92 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s（在此收集荧光），40 个循环。 试验数据处理 10.1 结果分析条件设定 读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根 据仪器噪音情况进行调整。 10.2 质控标准 10.2.1 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。 10.2.2 阳性对照的 Ct 值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线。 10.2.3 如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此实验视为无效。 10.3 结果判定 10.3.1 阴性 无Ct值且无扩增曲线，或只出现单一通道有荧光信号，均判为阴性。报告样品中不存在 H3N8 亚型 马流感病毒核酸。 10.3.2 阳性 Ct值均≤30.0，且HA基因与NA基因同时扩增出特定的扩增曲线，判为阳性，报告样品中存在H3N8 亚型马流感病毒核酸。 10.3.3 有效原则 Ct值＞30.0的样本建议重做，重做结果无Ct者为阴性，否则为阳性。 11 试验报告 试验报告至少应给出以下几个方面的内容： a) 试验对象； b) 所使用的标准（包括发布或出版年号）； c) 所使用的方法（如果标准中包括多个方法）； d) 结果； e) 观察到的异常现象； f) 试验日期。 _________________________________ 4