ICS 67.120 C 53 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 822—2020 代替 DB34/T 822-2008 动物组织中地西泮的残留测定 吸附法 Determination of diazepam residue in animal tissues immunosorbent assay 酶联免疫 Enzyme-linked 文稿版次选择 2020 - 08 - 03 发布 安徽省市场监督管理局 2020 - 09 - 03 实施 发 布 DB34/T 822—2020 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准代替 DB34/T 822-2008《动物组织中地西泮的残留测定－酶联免疫吸附法》，除编辑性修改 外主要技术变化如下： ——修改了标准名称，删除了标准名称中的连接符“-”； ——修改了试剂和溶液内容（见第 4 章）； ——将上一版本第 3 章试样制备和 7.1 样品处理合并为第 6 章试样制备，优化了样品处理方法（见 第 6 章）； ——增加了匀浆机、离心机的参数要求（见 5.2 和 5.3）； ——修改百分吸光度值为相对吸光度，增加了稀释倍数换算描述（见第 8 章）； ——提高了检测灵敏度，检测限修改为 1.0 μg/kg（见 9.1），且删除了灵敏度在第 1 章中的表述； ——修改确认方法表述（见 10.2）。 本标准由安徽省兽药饲料监察所提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽省兽药饲料监察所、安徽华测检测技术有限公司、宁国市金鼎家庭农场、合 肥市动物疫病预防与控制中心、安徽华澳生物技术有限公司、安徽省农产品质量安全检测中心、合肥市 动物卫生监督所、安徽省水产技术推广总站、铜陵市义安区畜牧兽医局、宁国市自然资源和规划局。 本标准主要起草人：许世富、郑新勇、李生龙、卞红正、何广、汪桃花、徐勇、许晓靖、孙德祥、 刘红云、何为俊、王美娟。 I DB34/T 822—2020 动物组织中地西泮的残留测定 酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了动物肌肉、肝脏、肾脏中地西泮残留测定的酶联免疫吸附测定方法。 本标准适用于动物肌肉、肝脏、肾脏中地西泮残留的快速测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 残留在组织中的地西泮经提取后，用于酶联免疫分析。试样中的地西泮抗原与包被于微孔板中的地 西泮特异性抗体进行免疫竞争性反应，加入一定量的显色底物和终止液，在 450 nm 处进行吸光度测量， 试样中地西泮的含量与颜色成反比。换算后可以获得样本中地西泮的含量。 4 试剂和溶液 4.1 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 规定的二级水。 4.2 竞争酶标免疫法地西泮检测试剂盒 2℃～8℃冰箱中保存。 4.2.1 微孔板：包被有地西泮抗体。 4.2.2 地西泮标准溶液：1 μg/mL。 4.2.3 地西泮标准工作液：0 μg/L，0.1 μg/L，0.2 μg/L，0.4 μg/L，0.8 μg/L，1.6 μg/L。 4.2.4 酶标二抗。 4.2.5 抗体工作液。 4.2.6 浓缩复溶液：0.5％磷酸盐缓冲液。 4.2.7 浓缩洗涤液：含 1.0％吐温 20 的磷酸盐缓冲液（pH 为 7.4）。 4.2.8 底物 A 液：TMB 缓冲液。 4.2.9 底物 B 液：双氧水溶液。 4.2.10 显色剂。 4.2.11 终止液：2 mol/L 的硫酸溶液。 4.3 洗涤工作液：用水 20 倍稀释厂商提供的浓缩洗涤液。 4.4 复溶工作液：用水 2 倍稀释厂商提供的浓缩复溶液。 4.5 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液：称取 0.4 g 氢氧化钠，加水定容至 100 mL，混匀备用。 4.6 正己烷。 1 DB34/T 822—2020 5 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 6 酶标仪（带 450 nm 滤光片）。 匀浆机：≥10 000 rpm。 离心机：≥5 000 rpm。 分析天平：感量 0.01 g。 氮吹仪。 振荡器。 离心管：20 mL。 微量移液器及配套吸头：（单道 50 μL，100 μL，1 000 μL，多道 50 μL～300 μL）。 试样制备 6.1 样品处理 动物肌肉、肝脏、肾脏，去筋后切成小块，制成肉糜后，10 000 rpm 均质 2 min，取 2 g± 0.05 g 均质样品，加入 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液（4.5）8 mL，震荡混匀 5 min，5 000 rpm 离心 10 min， 取 1 mL 上清液于另一离心管中，加入 10 mL 正己烷（4.6），震荡混匀 5 min，5 000 rpm 离心 5 min， 取上层正己烷 5 mL，50℃氮气吹干，加 1 mL 样品复溶工作液（4.4）溶解，取 50 μL 上清液用于检 测。 6.2 样品贮存 将试样按照测试和备用分别存放于 -20℃～-16℃条件下保存。 7 测定步骤 7.1 测定在室温 20℃～25℃条件下操作，测定之前将试剂盒以及所有试剂在室温（20℃～25℃）下放 置 1 h～2 h。 7.2 按标准样品和测定样品数量，取孔条插入微孔架，标准和样品做两个平行实验，记录下标准和样 品的位置。 7.3 在标准品和样品孔条中，分别加入 50 μL 相对应的标准品或样品溶液。 7.4 在所有孔中加入抗体工作液 50 µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置 25℃避光环境中反应 30 min。 7.5 揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液（4.3）250 µL/孔，充分洗涤 4 次～5 次，每次 间隔 10 s，倾出板孔内洗涤液，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。 7.6 加入酶标二抗 100 µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置 25℃避光环境中反应 30 min，取出 重复洗板步骤（7.5）。 7.7 加入底物液 A 液 50 µL/孔，再加入底物液 B 液 50 µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置 25℃ 避光环境中反应 15 min（在加入底物液 A 液和底物液 B 液后，一般显色为 15 min；若颜色较浅，可延 长反应时间到 20 min 或更长，但不得超过 25 min；反之，则减短反应时间）。 7.8 加入终止液 50 µL/孔，轻轻振荡混匀，5 min 内在 450 nm 下检测吸光度值。 8 结果判定与表述 2 DB34/T 822—2020 用获得的标准溶液和试样溶液吸光度值的比值进行计算，见式（1）： 按式（1）计算相对吸光度值： 相对吸光度值（％）= B ×100％ .............................. (1) B0 式中： B ——标准溶液或供试样品的吸光度值； Bo ——空白（浓度为 0 标准溶液）的吸光度值。 将计算的相对吸光度值（％）对应地西泮标准溶液浓度（µg/L）的自然对数作半对数坐标系统曲 线图，对应的试样浓度可从校正曲线算出。结果乘上相应的稀释倍数，即得样品中地西泮药物含量。 9 9.1 检测方法灵敏度、准确度、精密度 灵敏度 本方法在动物肌肉、肝脏、肾脏中的检测限为 1.0 μg/kg。 9.2 准确度 本方法在 2.0 μg/kg 添加浓度水平上的回收率为 80％～100％。 9.3 精密度 本方法的批内变异系数 CV％≤10％，批间变异系数 CV％≤15％。 10 其他 10.1 本方法动物组织稀释倍数为 10。 10.2 本方法为快速测定法，检测结果小于 1.0 μg/kg 时可判为未检出，大于或等于 1.0 μg/kg 时认 为可疑，应使用色谱质谱联用法进行确认。 10.3 试剂盒可能存在交叉反应，不同品牌的试剂盒，其操作步骤可能略有差别，具体操作步骤可根据 试剂盒使用说明书略作调整。 _________________________________ 3