(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210561319.6 (22)申请日 2022.05.23 (71)申请人 安徽医科 大学 地址 230032 安徽省合肥市梅 山路81号 (72)发明人 秦盼柱　黄琳　王浩宇　陈伟　 (74)专利代理 机构 重庆上义众和专利代理事务 所(普通合伙) 50225 专利代理师 孙人鹏 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) G01N 33/558(2006.01) G01N 33/569(2006.01) G01N 33/577(2006.01)G01N 33/58(2006.01) C12R 1/445(2006.01) (54)发明名称 CRISPR/Cas9介导的金黄色葡萄球菌检测等 温核酸扩增方法、 试纸条及其应用 (57)摘要 本发明涉及生物医学技术领域， 具体为 CRISPR/Cas9介导的金黄色葡萄球菌检测等温核 酸扩增方法、 试纸条及其应用， 所述针对金黄色 葡萄球菌的引物对分别如SEQ  ID NO.1和SEQ  ID  NO.2所示。 所述CRISPR/Cas9包括Cas9蛋白和 sgRNA， 所述sgRNA序列如SEQ  ID NO.3所示。 所述 侧向流层析技术包括支撑板， 所述支撑板的上端 面包括依次设置的上样区、 标记区、 划线区及吸 水区， 所述标记区上承载金标抗体， 所述划线区 内设置结合捕获探针的检测线T和二抗的质控线 C， 所述捕获探针序列如SEQ  ID NO.4。 本发明的 检测方法特异性好， 灵敏度高， 特异性好， 重复性 好， 操作简单， 适用性强。 权利要求书2页 说明书7页 序列表1页 附图1页 CN 114717345 A 2022.07.08 CN 114717345 A 1.CRISPR/Cas9介导的金黄色葡萄球菌检测等温核酸扩增方法， 其特征在于： 其步骤包 括： S1： 提取待检测金黄色葡萄球菌样本中的DNA， 使用裂解液和蛋白酶K溶液使待检测样 品裂解， 再加入羧基修饰的磁珠和包被液， 所获DNA经洗涤液洗涤， 之后用重悬液重悬， 获得 检测样品的DNA； S2： 采用针对金黄色葡萄球菌的引物对， 在恒定温度下进行RPA扩增一段时间， 获得一 端FITC功能化的双链产物； S3： 将适量Cas9蛋白、 sgRNA和双链产物在 上样缓冲溶液中混合， 并孵育一段时间， 将复 合物加入侧向流层析试纸条的检测区进行检测， 根据检测线的显色结果 实现待检测样品中 金黄色葡萄球菌的定性或定量检测。 2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9介导的金黄色葡萄球菌检测等温核酸扩增方法， 其特征在于： 所述引物对包括有第一引物和 第二引物， 所述第一引物、 第二引物的序列分别 如SEQ ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示， 所述第一引物的5 ’端用FITC标记。 3.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9介导的金黄色葡萄球菌检测等温核酸扩增方法， 其特征在于： 所述sgRNA的序列如SEQ  ID NO.3所示。 4.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9介导的金黄色葡萄球菌检测等温核酸扩增方法， 其特征在于： 所述裂解液包含Tris ‑HCl缓冲液、 乙二胺四乙酸、 氯化钠和十二烷基硫酸钠， 其中所述的Tris ‑HCl缓冲液的pH值为7.2 ‑8.8， 浓度为5 ‑20mmol/L， 所述乙二胺四乙酸的浓 度为1‑25mmol/L， 所述氯化钠的浓度为100 ‑600mmol/L， 所述十二烷基硫酸钠与裂解液的质 量体积比为0.5 ‑1.5g/100mL； 所述蛋白酶K 溶液的终浓度为20mg/mL； 所述包被液包含聚乙二醇和氯化钠， 所述聚乙二醇的质均分子量为400 ‑20000， 所述聚 乙二醇与包被液的质量体积比为10 ‑20g/100mL， 所述包被液中氯化钠的浓度为0.2 ‑ 2.0mol/L； 所述洗涤液包括乙醇含量 为50‑75vt％的水 溶液； 所述重悬液包括Tris ‑HCl缓冲液和乙二胺四乙酸， 其中， 所述Tris ‑HCl缓冲液的pH值 为7.2‑8.8， 浓度为5 ‑20mmol/L， 所述乙二胺四乙酸的浓度为1 ‑25mmol/L。 所述的RPA扩增的引物对 浓度为20 0‑800nmol/L； 所述的恒定温度为3 5‑42℃； 所述的RPA扩增的时间为15 ‑40min。 所述的Cas9的浓度为5 0‑500nmol/L； 所述的sgRNA浓度为5 0‑500nmol/L； 所述的双链产物体积为1 ‑20 μL； 所述上样缓冲溶液包含PB缓冲液、 氯化钠和聚乙二醇， 其中， 所述PB缓冲液的pH值为 7.0‑8.6， 浓度为10 ‑100nmol/L， 所述氯化钠的浓度为50 ‑500mmol/L， 所述缓冲液的体积为 5‑15μL， 所述聚乙二醇的分子量为200 ‑10000， 所述聚乙二醇与缓冲溶液的质量体积比为 0.5‑2.0g/100mL； 所述的孵 育时间为1 ‑10min。 5.一种如根据权利要求1所述的侧向流层析试纸条， 其特征在于： 所述侧向流层析试纸权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114717345 A 2条， 包括支撑板， 所述支撑板的上端面包括 沿设定方向依次设置的上样区、 承载FITC抗体偶 联的金纳米粒子的标记区、 划线区及吸水区， 所述划线区内设置有检测线T和质控线C， 且所 述检测线和质控线分别结合有捕获探针和二 抗， 所述捕获探针序列如SEQ  ID NO.4。 6.根据权利 要求5所述的侧向流层析试纸条， 其特征在于： 所述FITC抗体选自FITC的单 克隆抗体， 浓度为0.5 ‑3.0mg/mL； 所述金纳米粒子为15 ‑40nm； 所述捕获探针通过链霉亲和 素‑生物素作用固定到划线区， 所述捕获探针浓度为5 ‑100 μmol/L， 所述链霉亲和素浓度为 0.5‑4.0mg/mL； 所述 二抗选自FITC抗体的兔抗鼠抗体， 浓度为0.5 ‑3.0mg/mL。 7.根据权利要求5所述的侧向流层析试纸条， 其特征在于： 所述支撑板包括不吸水或疏 水的纸板、 塑料板或聚苯乙烯板； 所述上样区的材质包括 玻璃纤维棉或聚酯膜； 所述划线区 的材质包括硝酸纤维素膜或纯纤维素膜； 所述吸水区的材质包括滤纸。 8.根据权利要求5所述的侧向流层析 试纸条的制备 方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： A1： 将金纳米粒子与FITC抗体偶联， 使用浓度为10 ‑100mmol/L的碳酸钾溶液调节金纳 米粒子溶液的pH值至6.0 ‑7.0， 之后加入FITC抗体孵育， 再加入BSA溶液封闭， 制得FITC抗体 偶联的金纳米粒子； A2： 将FITC抗体偶联的金纳米粒子施加于标记区， 将捕获探针和链霉亲和素混合后固 定为划线区的检测线 T， 将二抗固定为划线区的质控线C； A3： 将上样区、 标记区、 划线区和吸水区沿设定方向依次设置在支持支撑板上， 获得所 述的侧向流层析 试纸条。 9.一种如权利要求5 ‑8任意一项所述的侧向流层析试纸条， 其特征在于： 该侧向流层析 试纸条用于检测金黄色葡萄球菌的样品。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114717345 A 3