(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210808754.4 (22)申请日 2022.07.11 (71)申请人 滨州医学院 地址 264003 山东省烟台市莱山区滨州医 学院 (72)发明人 王斌　王孟阳　黄盼盼　胡涛　 (74)专利代理 机构 北京方圆嘉 禾知识产权代理 有限公司 1 1385 专利代理师 任霜 (51)Int.Cl. C12N 5/0781(2010.01) C12N 5/0783(2010.01) C12N 5/0784(2010.01) C12N 5/0786(2010.01) C12M 1/26(2006.01)C12M 1/24(2006.01) C12M 1/12(2006.01) C12M 1/00(2006.01) (54)发明名称 一种提取小鼠肠道固有层淋巴细胞的试剂 及其应用和方法 (57)摘要 本发明属于细胞提取技术领域， 具体涉及一 种提取小鼠肠道固有层淋巴细胞的试剂及其应 用和方法。 本发 明所述提取小鼠肠 道固有层淋巴 细胞的试剂， 包括消化液A、 消化液B、 percoll、 DMEM培养基、 FBS和PBS； 所述消化液A包括 0.2wt.％EDTA、 10mMHEPES、 1wt.％青霉素 ‑链霉 素双抗和余量的PBS； 所述消化液B包括1mg/mL胶 原酶II、 1mg/mL中性蛋白酶、 0.5mg/mLDNA酶I、 1wt.％青霉素 ‑链霉素双抗和余量的含10％FBS 的DMEM。 利用本发明所述试剂处理待提取的小鼠 肠段， 能够得到更多数量的小鼠肠 道固有层淋巴 细胞， 并且提取时间短， 效率高。 权利要求书1页 说明书8页 附图3页 CN 115011558 A 2022.09.06 CN 115011558 A 1.一种提取小鼠肠道固有层淋巴细胞的试剂， 其特征在于， 包括消化液A、 消化液B、 percoll、 DMEM培养基、 FBS和PBS； 所述消化液A包括0.2wt.％EDTA、 10mM  HEPES、 1wt.％青霉素 ‑链霉素双抗和余量的 PBS； 所述消化液B包括1mg/mL胶原酶II、 1mg/mL中性蛋白酶、 0.5mg/mL  DNA酶I、 1wt.％青霉 素‑链霉素双抗和余 量的含10％FBS的DM EM。 2.根据权利要求1所述的试剂， 其特 征在于， 还 包括1640 培养基。 3.权利要求1或2所述的试剂在制备小鼠肠道固有层淋巴细胞提取 试剂盒中的应用。 4.一种提取小鼠肠道固有层淋巴细胞的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 依次利用权利要求1或2所述试剂中的消化液A和消化液B处理待提取的小鼠肠段， 分 离， 得肠固有层 细胞； 利用40％percoll离心液重悬肠固有层细胞后， 将重悬所得肠固有层细胞悬液缓慢加 在75％～80％perco ll离心液上方， 离心， 收集白膜层； 所述白膜层含有所述小鼠肠道固有层淋巴细胞； 以体积百分含量计， 所述40％percoll离心液包括： 40％percoll原液、 10％FBS和50％ DMEM培养基； 以体积百分含量计， 所述75％～80％percoll离心液包括： 75％～80％percoll原液、 10％～20％FBS和10％～12.5％DM EM培养基； 以体积百分含量计， 所述perco ll原液包括90％perco ll和10％10 ×PBS。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述消化液A处理的温度为1～5℃， 处理的 时间为20mi n。 6.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述消化液B处理的温度为37℃， 处理的时 间为60min， 处理的转速为20 0～250r/min。 7.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述分离的方式包括过筛和离心； 所述过 筛包括： 收集经消化液A和消化液B处理的小鼠肠段的消化液， 依次过70 μm细胞筛网和40 μm 细胞筛网。 8.根据权利 要求4所述的方法， 其特征在于， 所述离心的温度为20～25℃， 离心力为350 ～400g， 时间为20mi n。 9.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 收集白膜层后， 还包括： 利用PBS溶液或 1640培养基重悬白膜层细胞， 离心得所述小鼠肠道固有层淋巴细胞； 所述离心的温度为4 ℃， 离心力为 400～500g， 时间为10～15mi n。 10.一种消化装置， 其特征在于， 包括封闭层(1)、 容器(2)和固定元件(3)； 所述封闭层 (1)上带孔， 所述固定元件(3)通过 所述孔深入所述 容器(2)内部 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115011558 A 2一种提取小鼠肠道固有层淋巴细胞的试剂及其应用和方 法 技术领域 [0001]本发明属于细胞提取技术领域， 具体涉及 一种提取小鼠肠道固有层淋巴细胞的试 剂及其应用和方法。 背景技术 [0002]肠道固有层淋巴细胞是属于肠道免疫系统的固有淋巴细胞(innate  lymphoid   cells,ILCs)， 主要包括树突状细胞、 巨噬细胞、 NK细胞、 淋巴细胞(B细胞和 T细胞)、 肥大细 胞和粒细胞等。 这些免疫细胞存在于肠道相关淋巴组织(gut ‑associated  lymphoid   tissue， GALT)内， 共同构成了人体肠道免疫的 “第一防线 ”。 其功能包括非特异性的识别并 杀伤病原体以及特异 性免疫的抗原传递及下游的适应性免疫应答。 GA LT从组织学上主要包 括肠道集合淋巴结、 隐窝结、 孤立淋巴滤泡、 阑尾以及肠系膜淋巴结等结构。 肠道的免疫细 胞广泛分布于上述结构， 在维持肠道稳态和肿瘤免疫等诸多功能中发挥着重要的作用。 [0003]近年来， 已经有诸多的证据表明， 有诸多物质可以对肠道的免疫细胞产生作用， 例 如在胃肠道定殖微生物的代谢物可以引导树突状细胞产生不同的分化结果， 从而引起树突 状细胞的呈递抗原的功能差异， 进而引起肠道免疫功能的差异。 此外， 肠道的免疫失调可以 引起多种消化道系统表现甚至疾病， 例如食物过敏、 肠易激综合征， 甚至是炎症性肠病、 胃 癌等。 借由小鼠模型的肠道固有层淋巴细胞的提取可以从一个新的角度进 行相关疾病的研 究， 然而现有的提取方式得到的淋巴细胞的比例极不稳定， 获取效率低， 使得这些提取方法 不能应用。 开发一种新的高效提取肠道固有层淋巴细胞的方法非常有必要， 提高淋巴细胞 获取比例， 并且提高提取 的效率， 可以为基础和临床实验提供一个有效的淋巴细胞获取途 径。 发明内容 [0004]本发明的目的在于提供一种提取小鼠肠道固有层淋巴细胞的试剂及其应用和方 法， 提高淋巴细胞获取比例， 提高提取效率。 [0005]本发明提供了一种提取小鼠肠道固有层淋巴细胞的试剂， 包括消化液A、 消化液B、 percoll、 DMEM培养基、 FBS和PBS； [0006]所述消化液A包括0.2wt.％EDTA、 10mM  HEPES、 1wt.％青霉素 ‑链霉素双抗和余量 的PBS； [0007]所述消化液B包括 1mg/mL胶原酶II、 1mg/ mL中性蛋白酶、 0.5 mg/mL DNA酶I、 1wt.％ 青霉素‑链霉素双抗和余 量的含10％FBS的DM EM。 [0008]优选的， 还 包括1640 培养基。 [0009]本发明还提供了所述的试剂在制备小鼠肠道固有层淋巴细胞提取试剂盒中的应 用。 [0010]本发明还提供了一种提取小鼠肠道固有层淋巴细胞的方法， 包括如下步骤： [0011]依次利用上述技术方案所述试剂中的消化液A和消化液B处理待提取的小鼠肠段，说　明　书 1/8 页 3 CN 115011558 A 3