(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210926077.6 (22)申请日 2022.08.03 (71)申请人 中国医科 大学 地址 110122 辽宁省沈阳市沈北新区蒲河 路77号 (72)发明人 方瑾　岳帅　路盈盈　 (74)专利代理 机构 沈阳亚泰专利商标代理有限 公司 21107 专利代理师 史力伏 (51)Int.Cl. C12M 3/00(2006.01) C12M 1/00(2006.01) C12N 5/09(2010.01) G01N 33/569(2006.01) G01N 33/58(2006.01)B01L 3/00(2006.01) (54)发明名称 一种循环肿瘤细胞分选及单细胞水平多维 度异质性分析的微 流控芯片及应用 (57)摘要 本发明涉及了一种循环肿瘤细胞分选及单 细胞水平多维度异质性分析的微流控芯片及应 用， 属于微流控芯片技术领域。 具体涉及基于螺 旋结构和单细胞阵列结构相结合的级联式微流 控芯片系统。 所述芯片依次包含两级结构： 一级 螺旋结构和二级单细胞阵列结构。 一级结构用于 依据细胞大小从血液中快速去除大量血细胞， 二 级结构用于以单细胞形式捕获循环肿瘤细胞， 并 进行基于单细胞水平的循环肿瘤细胞异质性分 析。 以此芯片系统实现循环肿瘤细胞以单细胞的 形式被高效捕获， 进一步原位进行单细胞水平循 环肿瘤细胞分子和功能异质性分析。 权利要求书2页 说明书5页 附图4页 CN 115029244 A 2022.09.09 CN 115029244 A 1.一种循环肿瘤细胞分选及单细胞水平多维度异质性分析的微流控芯片系统， 其特征 在于， 所述芯片系统是基于螺旋分选结构和单细胞阵列结构相结合的级联微流控芯片系 统； 所述第一级螺旋分选结构包括： 一个注液孔 （1） 、 一个具有周期性扩张结构的螺旋通道 （2） 、 两个血细胞出口 （3） 和一个肿瘤细胞出口 （4） 组成； 第二级单细胞阵列结构包括： 三角 形扩张结构 （5） 、 由带有微缝的马蹄形 结构排列组成的单细胞阵列 （6） 和开 放区域 （7） 。 2.根据权利要求1所述的微流控芯片系统， 其特征在于， 所述第 一级螺旋分选结构用于 快速去除大量血细胞； 所述第二级 单细胞阵列结构用于以单细胞形式高纯度捕获CTC； 将上 述两级结构级联后能够提高CTC分选性能。 3.根据权利要求1所述的微流控芯片系统， 其特征在于， 所述第 一级螺旋分选结构中周 期性扩张结构的螺旋通道结构中扩张结构的宽为100~500 μm， 长为500~2000 μm， 非扩张结构 的宽为50~250 μm， 两个扩张结构的间距为250~1000 μm， 上一道螺旋通道中扩张结构与下一 道螺旋通道间距为20 0~500 μm。 4.根据权利要求1所述的微流控芯片系统， 其特征在于， 所述单细胞阵列结构中三角形 扩张结构 （5） 使流体从肿瘤细胞出口 （4） 流出后流速显著降低， 进而保证肿瘤细胞在单细胞 阵列 （6） 中被捕获。 5.根据权利要求1所述的微流控芯片系统， 其特征在于， 所述单细胞阵列结构包括横向 10~150列， 纵向10~150行带有微缝的马蹄形单细胞微缝结构； 每个马蹄形微缝结构由一对 对称的边界组成， 顶端有20~40 μm开口保证肿瘤细胞以单细胞形式进入 该结构， 底部5~12 μm 微缝保证单个肿瘤被捕获于该结构， 并提供细胞迁移和侵袭的通道， 阵列结构横向和纵向 空隙为20~60 μm保证液流在芯片中稳定通过。 6.根据权利要求1所述的微流控芯片系统， 其特征在于， 所述单细胞阵列结构中单细胞 阵列 （6） 和开放区域 （7） 连通； 当芯片置于含有细胞培养基的细胞培养皿中， 芯片外的液体 可通过开放区域 （7） 扩散进入芯片内部； 当芯片内外施加不同浓度趋化因子或营养条件时， 可形成由芯片外 至芯片内的浓度梯度。 7.根据权利要求1所述的微流控芯片系统， 其特征在于， 所述单细胞阵列结构中肿瘤细 胞以单细胞形式被捕获于单细胞阵列 （6） 中， 可以原位进行肿瘤细胞分子表型和功能表型 的异质性分析， 以及单细胞原位动态变化的实时监测。 8.根据权利要求1所述的微流控芯片， 其特征在于， 所述芯片由基底层和流道层互相键 合封装， 所述流道层的材料为聚二甲基硅氧烷、 环烯烃类共聚物、 聚碳酸酯或聚甲基丙烯 酸 甲酯， 所述基底层的材 料为二氧化硅、 硅片、 聚二甲基硅氧烷或硅化玻璃。 9.一种循环肿瘤细胞分选及单细胞水平多维度异质性分析的微流控芯片系统的使用 方法， 其特 征在于包括以下步骤： a. 取肿瘤患者外周血， PBS进行稀释， 将外周血稀释液从注液孔 （1） 泵入芯片， 肿瘤细 胞流经螺旋通道 （2） 、 肿瘤细胞出口 （4） 、 三角形扩张结构 （5） 进入单细胞阵列 （6） 被以单细 胞形式捕获， 血细胞流经螺旋通道 （2） 从血细胞出口 （3） 和开放区域 （7） 流出； 待血液样品全 部泵入芯片后， 通入PBS至芯片内无 血细胞残留； b. 对捕获的CTC进行相关标志物免疫荧光染色， 确定CTC的捕获数量和分析单细胞水 平CTC的分子表型异质性； c. 向芯片内加入含有低浓度FBS细胞培养基稀释的基质胶， 将芯片置于细胞培养皿权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115029244 A 2中， 并向培养皿中加入含有高浓度FBS细胞培养基， 使芯片内部形成驱动CTC迁移、 侵袭的血 清浓度梯度， 置于细胞培养箱中培养， 并定时对芯片内同一位置细胞状态进行拍摄， 记录细 胞行为变化； 另外， 将培养皿置于活细胞动态监测系统中， 对细胞进行持续拍摄， 记录同一 视野内不同肿瘤细胞的实时行为变化； 以上步骤实现单细胞水平CTC的功能表型异质性分 析。 10.根据权利 要求9所述的使用方法， 其特征在于， 步骤b中所述相关标志物包括EpCAM、 E‑cadherin、 CK8、 CK18和CK19中的至少一种作为上皮细胞类型标志蛋白质， 和/或选自N ‑ cadherin、 Vimentin、 Fibronectin、 ZEB1和Snail中的至少一种作为间质细胞类型标志蛋白 质， 和白细胞 标志物CD45。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115029244 A 3