(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211199868.X (22)申请日 2022.09.29 (71)申请人 苏州合普生医疗科技有限公司 地址 215000 江苏省苏州市太 仓市沙溪镇 昭溪路101号太 仓星药港 3幢3层 (72)发明人 刘小诗　唐源　 (74)专利代理 机构 北京同辉知识产权代理事务 所(普通合伙) 11357 专利代理师 李晓峰 (51)Int.Cl. C12M 1/12(2006.01) C12M 1/00(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) B01L 3/00(2006.01) (54)发明名称 单细胞表型测定微流控芯片及其制备、 测定 方法和应用 (57)摘要 本发明涉及单细胞表型测定微流控芯片及 其制备、 测定方法和应用， 包括第一上室、 第二上 室、 第一下室和第二下室， 第一上室与连接主路 通道相连接的连接支路通道内设置有单细胞滤 器， 抑或是第二上室与连接主路通道相连接的连 接支路通道内设置有单细胞滤器， 连接主路通道 内设置有并行微通道阵列， 并行微通道阵列包括 若干个从左至右依次均匀并列设置的微通道， 微 通道内设置有L型结构 的捕获陷阱结构。 本发明 的微流控芯片的捕获陷阱结构为带缺刻结构的L 型结构， 与微通道壁共同形成具有单向流动捕获 能力的单细胞捕获陷阱结构， 可以降低液体单壁 回流， 提高单细胞捕获效率。 权利要求书2页 说明书13页 附图9页 CN 115369012 A 2022.11.22 CN 115369012 A 1.单细胞表型测定微流控芯片， 包括第一上室(1)、 第二上室(2)、 第一下室(3)和第二 下室(4)， 所述第一上室(1)和第二上室(2)依次从左至右设置， 所述第一下室(3)位于第一 上室(1)的正下方， 所述第二下室(4)位于第二上室(2)的正下方， 所述第一上室(1)、 第二上 室(2)、 第一下室(3)和第二下室(4)分别通过连接支路通道(5)与位于中间位置的连接主路 通道(7)相连接； 其特征在于， 所述第一上室(1)与连接主路通道(7)相连接的连接支路通道 (5)内设置有 单细胞滤器(6)， 抑或是所述第二上室(2)与连接主路通道(7)相连接的连接支 路通道(5)内设置有 单细胞滤器(6)， 所述连接主路通道(7)内设置有并行微通道阵列， 所述 并行微通道阵列包括若干个从左至右依次均匀并列设置的微通道(8)， 所述微通道(8)内设 置有L型结构的捕获陷阱结构(9)。 2.如权利要求1所述的单细胞表型测定微流控芯片， 其特征在于， 所述捕获陷阱结构 (9)包括相对于微通道 壁(10)平行的陷阱平行段(11)以及相对于微通道 壁(10)垂直的陷阱 垂直段(12)， 且所述陷阱平行 段(11)和陷阱垂直段(12)之间设置有缺刻结构。 3.如权利要求2所述的单细胞表型测定微流控芯片， 其特征在于， 所述陷阱平行段(11) 的长度(L1)为15 ‑80μm， 所述陷阱垂直段(12)的长度(L2)为8 ‑20μm， 所述缺刻结构的长度 (L3)为2‑10 μm， 且所述陷阱垂直段(12)与微 通道壁(10)之间的间距(L 4)为2‑10 μm。 4.如权利要求1所述的单细胞表型测定微流控芯片， 其特征在于， 所述第一上室(1)、 第 二上室(2)、 第一下室(3)和第二下室(4)的面积在9 ‑100mm2之间， 所述微通道(8)的孔径为 20‑90 μm， 所述单细胞 滤器(6)由直径3 ‑30 μm、 间距10 ‑100 μm柱状列阵构成。 5.如权利要求1所述的单细胞表型测定微流控芯片的制备方法， 其特征在于， 依次包括 以下步骤： 步骤1、 在干净的硅片表面依次涂覆粘结剂及光刻胶， 将含有捕获陷阱结构/并行微通 道阵列的掩膜板置于光刻胶层上， 并在光刻设备中曝光， 移去掩膜板并用正胶显影液对光 刻胶层中未固化的光刻 胶进行冲洗， 得到光刻后材 料； 步骤2、 在光刻后材料表面沉积二氧化硅， 之后除去硅片表面剩余的光刻胶， 得到二氧 化硅掩膜的无胶硅片； 步骤3、 将二氧化硅掩膜的无胶硅片置于感应耦合等离子刻蚀机 中进行干法刻蚀， 得到 含有捕获陷阱结构/并行微 通道阵列的硅片模板； 步骤4、 用搅拌均匀的无泡PDMS浇筑制得的硅片模板， 放入烘箱中保持固化， 之后将 PDMS层从硅片模板完整分离， 通过两次脱模操作后将上下底板键合， 形成最终的微流控芯 片。 6.如权利要求5所述的单细胞表型测定微 流控芯片的制备 方法， 其特 征在于， 其中， 所述步骤1中， 所述的硅片为抛光后的硅晶圆片， 其厚度为100 ‑1000微米； 所述的粘结 剂为六甲基二硅氮 烷， 粘结剂的涂覆方式为旋涂、 喷涂或真空挥发； 所述的光刻胶为正性光 刻胶， 光刻胶的涂覆方式为旋 涂或喷涂； 所述步骤2中， 采用蒸镀或磁控溅射的方法沉积二氧化硅层， 该二氧化硅层的厚度为 10‑300纳米； 所述的除去硅片表面剩余的光刻 胶的方式为丙酮浸泡； 所述步骤3中， 所述的干法刻蚀气体包括四氟化碳气体、 六氟化硫气体、 八氟环丁烷气 体、 氧气、 氩气、 氦气中的一种气体或多种气体的组合， 刻蚀机中刻蚀腔 内的工作气压小于 50mTorr， 刻蚀时间为1 ‑120分钟；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115369012 A 2所述步骤4中， 采用PDMS与固化剂的比例为10： 1或8： 2或7： 3， 烘箱的温度为50 ‑90℃， 保 持固化的时间为3 0min‑240min。 7.如权利要求1所述的单细胞表型测定微流控芯片的测定方法， 其特征在于， 依次包括 步骤A、 单细胞捕获步骤和步骤B、 测定步骤， 其中， 步骤A、 单细胞捕获步骤， 依次包括： 步骤A1、 细胞通过酶法消化制成细胞 悬液， 滴加入第一上室(1)中； 步骤A2、 开启负压吸引器， 在第一下室(3)或第二下室(4)形成气体负压， 负压驱动使细 胞悬液吸入微 通道(8)， 且被捕获陷阱结构(9)所捕获； 步骤A3、 第一上室(1)加入生理/ 培养溶液， 利用负压清洗多余细胞， 并吸走废液； 步骤A4、 第一上室(1)中加入细胞培 养基后置 于细胞培 养箱中培 养； 步骤B、 测定步骤， 依次包括： 步骤B1、 单细胞捕获后， 在第二上室(2)加入含待测药物的培养基， 并于细胞培养箱中 培养12‑120小时； 步骤B2、 培养后， 对各个微通道进行显微成像， 并测量每个单细胞迁移离开捕 获陷阱结 构的距离， 取平均值； 其中， 迁移率 ＝样品单细胞迁移 距离/对照单细胞迁移 距离*100％； 趋化强度＝样品单细胞迁移 距离/对照单细胞迁移 距离*100％。 8.如权利要求1所述的单细胞表型测定微流控芯片的应用， 其特征在于， 所述的微流控 芯片应用于单细胞迁移能力测定， 单细胞为正常组织细胞或肿瘤细胞或微生物细胞， 微生 物为具有移动能力的微 生物。 9.如权利要求1所述的单细胞表型测定微流控芯片的应用， 其特征在于， 所述的微流控 芯片应用于 3D培养条件下 单细胞迁移能力测定， 3D培 养包括在芯片内灌注3D培 养基。 10.如权利要求1所述的单细胞表型测定微流控芯片的应用， 其特征在于， 所述的微流 控芯片应用于抗肿瘤迁移/转移的药物筛选和评估， 肿瘤细胞为 实体瘤细胞和单核/巨噬肿 瘤细胞。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115369012 A 3