ICS 11.220 CCS B 41 34 安 徽 省 地 方 标 准 DB34/T 3862—2021 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 2、7、12 型多 重 PCR 定型检测技术 Multilex PCR detection technology of Actinobacillus pleuropneumoniae type 2, 7, 12 2021-01-25 发布 2021-02-25 实施 安徽省市场监督管理局 发 布 DB34/T 3862—2021 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由安徽农业大学提出。 本文件由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：安徽农业大学、安徽浩翔农牧有限公司（农业农村部猪肉质量安全控制重点实验 室）、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽华杰农牧科技有限公司、和县农业农村局、望江县畜牧兽 医局、望江申江养殖有限公司。 本文件主要起草人：孙裴、高亚飞、占松鹤、王军、陈祥国、赵家喜、王杰、王希春、李杰、刘江、 王勇、徐前明。 I DB34/T 3862—2021 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 2、7、12 型多重 PCR 定型检测技术 1 范围 本文件确定了猪胸膜肺炎放线杆菌 2、7、12 型多重 PCR 定型检测技术，并规定了试剂和材料、 仪器和设备、样品的采集、运输和保存、操作步骤、结果判定、生物安全及防污染措施。 本文件适用于猪胸膜肺炎放线杆菌 2、7、12 型多重 PCR 定型检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 SN/T 1447 猪传染性胸膜肺炎检疫技术规范 SN/T 2025 动物检疫实验室生物安全操作规范 DB34/T 2997 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌检验操作规程 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试剂和材料 4.1 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合 GB/T 6682 规定中一级水的要求。 所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。 4.2 PCR 扩增试剂盒：2×Taq PCR Master Mix。 4.3 10×PCR 缓冲液。 4.4 1.0％琼脂糖凝胶。 4.5 5×TBE 电泳缓冲液。 4.6 DNA 分子量标准物：DNA marker LD2000。 4.7 PCR 扩增引物：序列见附录 B。 5 5.1 5.2 5.3 5.4 仪器和设备 电热压力蒸汽灭菌器。 电子天平：感量 0.1 g。 恒温震荡培养箱。 冰箱：2℃～5℃，-20℃。 1 DB34/T 3862—2021 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 5.13 5.14 6 高速冷冻离心机：最大离心力 17000 g 以上。 天平：量程 2 kg，感量 0.1 g。 pH 计。 涡旋振荡器。 PCR 扩增仪。 电泳仪：电压 10-300V ，电流 4-400mA，功率最大 75W。 凝胶成像系统：紫外透射面积 20×20-21×26cm，波长 302nm。 超净工作台。 微量移液器：0.5 µL～10 µL、5 µL～50 µL、20 µL～200 µL、100 µL～1 000 µL。 干热灭菌器。 样品的采集、运输和保存 6.1 采样要求 采样应符合 SN/T 1447 的相关规定。 6.2 采样工具 棉拭子、试管、剪刀、镊子、注射器，经湿热灭菌 30 min。 6.3 样品的采集 6.3.1 活体样品 用无菌棉拭子深入猪只鼻腔 5～8 cm，快速旋转棉头 3～5 圈，采集猪只鼻腔分泌物，放入无菌试 管中冷藏，1～2 小时内送往实验室供细菌分离。 6.3.2 组织样品 根据临床症状的不同采集典型病料。在猪只死亡 2 h 以内，用剪刀、镊子无菌采集肺脏、肺门淋 巴结、扁桃体等器官和鼻腔分泌物。 6.3.3 血液样品 用注射器无菌操作采集猪的血液，每头不少于 10 mL。无菌分离血清，分装，加盖密封后 4～8℃ 保存。 6.4 样品的运输与保存 6.4.1 采集的样品应置于低温、密封的容器内运输。 6.4.2 待检样品在 2℃～8℃条件下保存不应超过 24 h；若不能在规定时间内送检的，可保存于饱和 氯化钠溶液或 30％甘油缓冲盐水溶液中，但保存不应超过 72 h。 7 操作步骤 7.1 细菌分离、培养及鉴定 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌分离、培养及鉴定按照 DB34/T 2997 的规定执行。 2 DB34/T 3862—2021 7.2 细菌基因组 DNA 提取（煮沸法） 7.2.1 7.2.2 7.2.3 7.2.4 7.2.5 7.3 取 1 mL 过夜培养菌液加入 1.5 mL 离心管中，以 12000 r/min 离心 5 min； 弃上清液，加入 50 µL 双蒸水混匀； 置沸水中煮沸 10 min，再冰浴 5 min； 重复步骤 7.2.3，两次； 再以 12000 r/min 离心 5 min，取上清液即为 DNA 溶液。 PCR 扩增 7.3.1 PCR 反应体系：总体积为 50 µL，其中含有 12.5 µL 的 2×Taq PCR Master Mix，上、下游引 物（10 μmol/L）各 1 µL，DNA 模板 5 µL，去离子水补齐至 50 µL。 7.3.2 PCR 扩增参数：95℃预变性 5 min；95℃变性 50 s，63℃退火 50 s，72℃延伸 1 min，共 35 个循环；最后 72℃再延伸 10 min。 7.4 PCR 扩增产物电泳检测 7.4.1 用 100 mL 1×TAE 缓冲液制备 1.0％琼脂糖凝胶，加入 5 µL 10 mg/mL EB。 7.4.2 在 1×TAE 缓冲液中，取 7 μL PCR 扩增产物加入点样孔进行电泳，同时取 DNA 标准分子量加 入第一点样孔，电压 100 V，电流 100 A，电泳约 30 min。用凝胶成像仪观察分析，并记录、保存电 泳结果。 7.5 结果判定 7.5.1 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清 2、7、12 型的目的片段大小分别为 500、396、559 bp。 7.5.2 被检样品孔如发现出现扩增条带，且条带大小与 2、7、12 型其中一个相符，则判定为相应血清 型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。被检样品孔如未发现有扩增条带，则不属于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 2、7、12 型。 7.5.3 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 2、7、12 型 PCR 分型检测结果电泳图参见附录 B 图 B.1。 8 生物安全及防污染措施 生物安全措施和防污染措施应按照 GB 19489、GB/T 27401 和 SN/T 2025 的有关规定执行。 3 DB34/T 3862—2021 附 录 A （规范性） 试剂配制 A.1 试剂配制 A.1.1 10×PCR 缓冲液：200 mmoI/LTris-HCl（pH 8.4，室温），200 mmol/L 氯化钾，15 mmol/L 氯 化镁。 A.1.2 1.0％琼脂糖凝胶：称量 0.5 g 琼脂糖置于锥形瓶中，加入50 mL 1×TAE，微波炉煮沸 3 次至 琼脂糖全部融化，摇匀。 A.1.3 5×TBE 电泳缓冲液：称量 54 gTris、20 mL 0.5 M EDTA（pH 8.0）、27.5 g 硼酸，置于 1 L 烧杯中，加入约 800 mL 的去离子水，充分搅拌溶解。加去离子水将溶液定容至 1 L 后，室温保存。 4 DB34/T 3862—2021 附 录 B （规范性） 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 2、7、12 型引物序列 表B.1 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型 2、7、12 引物序列 血清型 2型 7型 12型 引物名称 Ap2F Ap2R Ap7F Ap7R Ap12F Ap12R 片段大小 引物序列 /bp （5’→3’） 500 396 559 ACT ATG GCA ATC AGT CGA TTC AT CCT AAT CGG AAA CGC CAT TCT G GGT GAC TGG CGT ACG CCA AA GGG CTG CAG ACT GAC GTA A GGT TCT CCA GAT GAC TCT GAA A GCT ATT GGA TGA AGA TGA CTC AT 5 DB34/T 38662—2021 附 录 C （ （资料性） 猪传 传染性胸膜肺 肺炎放线杆菌 菌 2、7、12 型 PCR 检测 测结果电泳图 M 1 2 3 4 － 2000    1000  750  500  图中： M：DNAA Marker 2000； －：阴 阴性对照； 1：猪传 传染性胸膜肺 肺炎放线杆菌 菌 2：猪传 传染性胸膜肺 肺炎放线杆菌 菌 3：猪传 传染性胸膜肺 肺炎放线杆菌 菌 4：猪传 传染性胸膜肺 肺炎放线杆菌 菌 2 型； 7 型； 12 型； 2、7、12 型。 图C.1 猪传染性胸 胸膜肺炎放线 线杆菌 2、7、12 型 PCR 检测结果电泳 检 泳图 6