(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210656836.1 (22)申请日 2022.06.11 (71)申请人 重庆医科 大学 地址 400016 重庆市渝中区医学院路1号 (72)发明人 冯涛　杨鑫玥　卢杨　霍本念　 刘洁　何雪梅　张婷　郑良栋　 (74)专利代理 机构 重庆立川知识产权代理事务 所(普通合伙) 50285 专利代理师 李启林 (51)Int.Cl. C12N 5/0735(2010.01) C12N 5/09(2010.01) A61K 35/545(2015.01) A61P 13/08(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种人胚胎干细胞与前列腺癌细胞共培养 制备抗前列腺癌药物的方法 (57)摘要 本发明提供一种人胚胎干细胞与前列腺癌 细胞共培养制备抗前列腺癌药物的方法。 人胚胎 干细胞能在体外培养、 具有发育全能性的干细 胞， 具有高度的自我更新、 无限增殖 以及多向分 化的能力。 发明人意外发现， 将人胚胎干细胞和 前列腺癌细胞进行直接接触共培养， 人胚胎干细 胞微环境受到其他肿瘤细胞的刺激， 会产生抑癌 生物学效应， 而产生 “抑肿瘤”分子， 因此可以提 取上清液运用到前列腺癌的治疗。 本发明的共培 养上清液在抑制前列腺癌细胞的增殖、 迁移和侵 袭方面表现出显著的治疗效果； 更重要的是， 共 培养上清液在体内抑制肿瘤的生长方面也表现 出明显的优势， 具有制备成抗前列腺癌药物的潜 力。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 115058387 A 2022.09.16 CN 115058387 A 1.一种人胚胎干细胞与前列腺癌细胞共培养制备抗前列腺癌药物的方法， 其特征在 于， 包括如下步骤： (1)预铺Mat rigel基质胶制备 人胚胎干细胞专用培 养板； (2)人胚胎干细胞进行消化传代； (3)使用步骤(1)预铺的Matrigel基质胶制 备人胚胎干细胞专用培养板进行人胚胎干 细胞接种； (4)取对数生长期的前列腺癌细 胞， 吸弃培养基后加入DPBS缓冲液清洗细胞， 用EDTA于 32‑42℃消化2 ‑6min， 吸去上清液， 用人胚胎干细胞完全培养基将前列腺癌细胞重悬为单个 细胞悬液， 将前列腺癌细胞数按培养体系中人胚胎干细胞的1： 1 ‑1： 5比例， 加入到人胚胎干 细胞培养体系中， 将两种细胞在32 ‑42℃的CO2细胞培养箱中进行共培 养； (5)共培养24‑96h后收取共培 养液； 所述人胚胎干细胞为已建立的干细胞系。 2.如权利要求1所述的方法， 其 特征在于： 所述培养基包括 人多潜能干细胞培 养基、 mTeSRTM1培养基、 Essential 8TM培养基、 DMEM/F12培养基的一种或两种。 3.如权利要求1或2所述的方法， 其特征在于： 所述预铺Matrigel基质胶制备人胚胎干 细胞专用培养板的方法为将Matrigel稀释后进行预铺细胞培养孔板， 在37℃恒温CO2细胞 培养箱中放置4 ‑12小时； 所述Matrigel稀释为Matrigel用DPBS 稀释， 其中Matrigel： DPBS＝ 1： 30‑1： 50。 4.如权利要求3所述的方法， 其特征在于： 人胚胎干细胞进行消化传代的方法为选取传 代培养中的人胚胎干细胞， 吸弃培养基后加入DPBS缓冲液清洗细胞， 加入细胞解离试剂干 细胞消化液， 放入培养箱中孵育， 肉 眼观察到细胞集落变得不透明且发白， 吸弃干细胞消化 液， 加入干细胞培 养基， 将细胞刮轻刮细胞成几十个细胞团块。 5.如权利要求4所述的方法， 其特征在于： 人胚胎干细胞接种的方法为取步骤(1)的孔 板， 吸弃配制Matrigel基质胶的基础工作液， 加入DPBS缓冲液清洗制备好的机制胶， 加入干 细胞培养基， 然后均匀接种步骤(2)的细胞团块悬液于制备好的Matrigel基质胶孔板中， 24h换液。 6.如权利要求5所述的方法， 其特征在于： 所述共培养的方法为待人胚胎干细胞状态成 熟， 取对数生长期的肿瘤细胞吸弃培养基后加入DPBS缓冲液清洗细胞两遍， 用EDTA消化37 ℃消化， 吸去 上清液， 用干细胞培养基将癌细胞重悬为单个细胞悬液， 将癌细胞数加入到人 胚胎干细胞培 养体系中， 将两种细胞在37℃恒温CO2细胞培养箱中进行共培 养。 7.如权利要求6所述的方法， 其特征在于： 人胚胎干细胞状态成熟为胚胎干细胞细胞汇 合度达到50％ ‑60％时、 克隆边缘平滑且无分化细胞、 细胞与细胞之间分散、 未发生融合的 情况。 8.如权利要求1所述的方法， 其特征在于： 收取共培养液为共培养24h ‑96h后用离心管 收取共培 养上清液， 离心， 再用微 孔滤膜过 滤， 收集上清液。 9.如权利要求1 ‑8任一项方法所制备的共培 养液在制备抗前列腺癌药物中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115058387 A 2一种人胚胎干细胞与前列腺癌细胞 共培养制备抗前列腺癌药 物的方法 技术领域 [0001]本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及 一种人胚胎干细胞与前列腺癌细胞共培 养制备抗前列腺癌药物的方法。 背景技术 [0002]前列腺癌(Prostate  cancer， PCa)  是一种好发于老年男性的恶性肿瘤， 其发病率 随年龄增加而增长。 前列腺癌在全世界范围内都具有较高的发病率。 每年全球有90多万新 发病例， 其中26万多病例因前列腺癌的恶化而死亡。 欧美国家前列腺癌的发病率明显高于 亚非地区。 在美 国， 前列腺癌占美 国男性肿瘤发病率的第一位。 在我国， 前列腺癌的发病率 较以往增长了近70％。 根据 《临床肿 瘤学杂志》  2013年第04期关于中国前列腺癌发病现状 和流行趋势分析 的报道， 我国前列腺癌的发病率呈现明显的持续增长趋势， 前列腺癌正成 为严重影响我国男性健康的泌尿系统恶性肿瘤。 随着我国社会老龄化现象日趋严重， 我国 前列腺癌的发病率可能会进入高峰期。 前列腺癌的临床表现主要为排尿困难， 呈渐进性地 出现尿频、 尿急、 血尿等症状并伴随排尿时的疼痛感或灼烧感及背 下部、 大腿上部或骨盆处 的连续疼痛。 前列腺癌肿瘤初期无任何临床表现， 常以出现转移症状为最早的就诊原因。 由 于前列腺癌潜伏期较长， 因而很难察觉， 发现时一般已经发展为晚期。 [0003]前列腺癌的生长和转移密切依赖于雄激素(如双氢睾酮)。 雄激素的分泌约90％来 自于睾丸。 雄激素被分泌后进入细胞可以与雄激素受体结合。 雄激素受体是一种重要的核 转录因子， 调控众多的基因表达和前列腺癌细胞增殖。 当雄激素与雄激素 受体结合后， 雄激 素受体进入细胞核启动基因表达， 从而促进前列腺癌生长和转移。 因此， 去雄激素治疗(包 括切除睾丸和药物抑制雄激素水平)对于大多数前列腺癌有明显疗效。 但去雄激素治疗对 肿瘤的控制一般仅能维持1 ‑4年， 几乎所有前列腺癌患者最终均转为雄激素非依赖性前列 腺癌， 进而发展为去势抵抗性前列腺癌。 此时， 去雄激素治疗也就失去了效果。 去势抵抗性 前列腺癌是导致前列腺癌病人死亡的重要原因。 去势抵抗性前列腺癌的发生机制有很多 种， 包括雄激素受体突变、 雄激素受体表达消失以及在低雄激素环境下雄激素不敏感的细 胞群扩增 等。 虽然去雄激素治疗没有效果， 但是在大多数去势抵抗性前列腺癌中雄激素受 体也同样扮演着重要的角色， 所以雄激素 受体是目前治疗普通前列腺癌和去势抵抗性前列 腺癌的重要靶点。 [0004]当今全球医疗界尚没有一种药物能单独治愈前列腺癌。 前列腺癌的主要治疗手段   包括手术、 放疗、 化疗及生物治疗， 不仅患者要 经历九死一生之痛， 家庭经济压力巨大， 负债 累累， 人们最不能接受的是患病 亲人承受了极大痛苦后最终还是要经历生死离别 之苦。 美 国食品和药物管理局(FDA)最新批准的治疗去势抵抗性前列腺癌的药物包括Abiraterone 和Enzalutamide， 前者是抑制雄激素的合成， 后者是雄激素 受体的拮抗剂， 这两种药物都是 针对雄激素受体信号通路， 在去势抵抗性前列腺癌的治疗方面取得显著疗效， 但是经过内 分泌治疗及 靶向雄激素受体药物治疗后， 病人依然会产生药物抵抗， 治疗效果十 分有限， 且说　明　书 1/5 页 3 CN 115058387 A 3