ICS 11.220 CCS B 41 35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1995—2021 禽心包积液-肝炎综合征荧光定量 PCR 诊断 技术 Fluorescence quantitative PCR diagnosis of fowl hydropercardium-hepatitis syndrome 2021 - 08 - 17 发布 2021 - 11 - 17 实施 福建省市场监督管理局 发 布 DB35/T 1995—2021 目 次 前言 ................................................................................. II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 疫病概述 ........................................................................... 1 5 设备、材料和试剂 ................................................................... 2 6 样品的采集、保存和处理 ............................................................. 2 7 样品中病毒 DNA 提取 ................................................................. 3 8 荧光定量 PCR 操作步骤 ............................................................... 3 9 结果判定 ........................................................................... 3 10 测序 .............................................................................. 4 附录 A（规范性） 试剂的配制及引物序列 ................................................. 5 附录 B（资料性） 扩增产物参考基因序列和荧光定量 PCR 扩增曲线图 ......................... 6 I DB35/T 1995—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由福建省农业科学院提出。 本文件由福建省农业农村厅归口。 本文件起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福州海关技术中心。 本文件主要起草人：施少华、陈珍、陈翠腾、叶洪、张体银、郑腾、黄瑜、朱春华、傅光华、程龙飞、 万春和、彭春香、刘荣昌、陈红梅、傅秋玲。 II DB35/T 1995—2021 禽心包积液-肝炎综合征荧光定量 PCR 诊断技术 1 范围 本文件规定了禽心包积液-肝炎综合征荧光定量PCR诊断技术的设备、材料和试剂，样品的采集、处 理和保存，样品中病毒DNA的提取，荧光定量PCR操作步骤及结果判定的技术要求。 本文件适用于禽心包积液-肝炎综合征的分子生物学诊断及流行病学监测。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 禽心包积液-肝炎综合征 fowl hydropercardium-hepatitis syndrome；HHS 由禽腺病毒4型引起禽类的以心包积液、肝炎为特点的一种综合征。 3.2 禽腺病毒 4 型 fowl adenovirus serotype 4；FAdV-4 引起禽心包积液-肝炎综合征的病原。 3.3 循环阈值 cycle threshold；Ct 值 荧光定量PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 疫病概述 禽心包积液-肝炎综合征（HHS），最早于1987年发生于巴基斯坦安卡拉地区。目前，该病呈现世界 范围分布，多个国家、地区相继报道该病的发生，各地分离到的毒株略有差异，但大多为FAdV-4，且具 有很强的致病性。2010年以来，我国多地发生了HHS，并从发病鸡群中分离到FAdV-4。该病主要临床特 征为心包充盈，心包内积有淡黄色液体或胶冻样物；肝脏呈现不同程度肿胀，质地较脆、易碎，有出血 斑或出血点；肾脏肿大、质地较脆，有的呈现“花斑肾”。该病主要发生于3～5周龄肉鸡，10～20周龄 蛋鸡偶有发生，有报道鸭、鹅、鸽及野鸟也可发生该病。发病鸡在4 d后开始死亡，死亡期可持续7 d～ 10 d，发病率和病死率分别为10%～30%和20%～75%。该病一年四季均可发生，以水平传播为主，也可垂 直传播，感染鸡排毒期可长达9周，发病日龄越早，死淘率越高。 1 DB35/T 1995—2021 5 设备、材料和试剂 5.1 设备 5.1.1 台式冷冻高速离心机（转速应＞12 000 r/min）。 5.1.2 水浴锅或金属浴。 5.1.3 微量可调移液器（量程分别为 100 µL～1 000 µL、20 µL～200 µL、2 µL～20 µL、0.5 µL～ 10 µL）。 5.1.4 荧光定量 PCR 仪。 5.1.5 旋涡混合仪 5.2 材料和试剂 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.2.5 5.2.6 5.2.7 5.2.8 5.2.9 5.2.10 5.2.11 棉拭子稀释液：配比按照附录 A 的 A.1。 组织稀释液：配比按照附录 A 的 A.2。 10% SDS 溶液：配比按照附录 A 的 A.3。 3 mol/L 醋酸钠缓冲液（pH5.2）：配比按照附录 A 的 A.4。 75%乙醇：配比按照附录 A 的 A.5。 荧光定量 PCR 检测用引物和探针的序列、使用方法：配比按照附录 A 的 A.6。 蛋白酶 K、Tris 饱和苯酚、酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）、无水乙醇：直接购买成品使用。 Probe qPCR 试剂盒：应与荧光定量 PCR 仪相配套的探针 qPCR 试剂盒。 PCR 反应管：与荧光定量 PCR 仪相配套的 PCR 反应管。 4 阳性对照：含 FAdV-4 目的基因片段的质粒 DNA（拷贝数≥2.13×10 /µL）。 阴性对照：Nuclease-free Water。 6 样品的采集、保存和处理 6.1 样品的采集 6.1.1 棉拭子样品的采样 将棉拭子插入咽喉或泄殖腔旋转3～5次，取出放入盛有1.0 mL棉拭子稀释液的1.5 mL无菌离心管中。 6.1.2 组织样品的采集 无菌采集病禽有明显病变的肝脏、脾脏等组织。 6.2 样品保存 样品采集后应保存在2 ℃～8 ℃条件下，24 h内送达实验室。超过24 h的应保存在-20 ℃条件下， 且时间不应超过7 d。如需长期保存，须保存在-70 ℃～-80 ℃条件下。 6.3 样品的处理 6.3.1 棉拭子样品的处理 取出棉拭子样品，于旋涡混合仪上振荡15 s，4 ℃、5 000 r/min离心10 min，取上清液备用。 2 DB35/T 1995—2021 6.3.2 组织样品的处理 取组织样品，按质量体积比（1:5）加入组织稀释液进行匀浆，转入1.5 mL无菌离心管中，反复冻 融2～3次后，4 ℃、5 000 r/min离心10 min，取上清液备用。 7 样品中病毒 DNA 提取 7.1 常规方法提取 DNA 7.1.1 取 540 μL 上清液，先加 60 μL 10% SDS 溶液后，再加蛋白酶 K 至终浓度 50 μg/mL，于旋涡混 合仪上混匀 15 s，置 56 ℃孵育 2 h。 7.1.2 加入等体积 Tris 饱和苯酚，于旋涡混合仪上混匀 15 s 后，置 4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min。 7.1.3 离心后吸取上清液转移至 1.5 mL 无菌离心管（注意不要吸出中间层），加入等体积酚:氯仿: 异戊醇（25:24:1），颠倒混匀 15 s，静置 5 min 后，置 4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min，吸取上清 液转至其他无菌离心管中。 7.1.4 重复 7.1.3 步骤 1 次。 7.1.5 加入相当于上清液 1/10 体积的 3 mol/L 的醋酸钠缓冲液（pH5.2）、2 倍体积的无水乙醇，颠 倒混匀 15 s，-20 ℃沉淀 2 h。 7.1.6 于 4 ℃下 12 000 r/min 离心 15 min 后倾去上清液，加入 800 μL 75%乙醇溶解沉淀物，置 4 ℃ 下 12 000 r/min 离心 5 min 后吸尽残余液体；再以 75%乙醇溶解沉淀物 1 次，置 4 ℃下 12 000 r/min 离心 5 min，吸尽残余液体；置 4 ℃下 12 000 r/min 离心 5 s 后吸尽残余液体，室温静置 5 min。 7.1.7 加入 50 μL 灭菌双蒸水溶解沉淀物，冰浴备用。提取的 DNA 应于 2 h 内进行荧光定量 PCR 或保 存于-20 ℃条件下。 7.2 商品化试剂盒提取 DNA 病毒DNA的提取，也可采用商品化DNA提取试剂盒提取。 8 荧光定量 PCR 操作步骤 在PCR反应管中分别加入以下试剂：Probe qPCR mix 10 µL，引物FAdV-4-F、FAdV-4-R各0.4 µL， 探针引物FAdV-4-P 0.8 µL，模板DNA 2.0 µL，加Nuclease-free Water至总体积20 µL，混匀，离心5 s。 将PCR反应管放入定量PCR仪，扩增反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共 40个循环；最后保存于4 ℃。同时，设立阳性对照和阴性对照各至少一个。 9 结果