ICS 11.220 B 441 45 4 广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准 CCS DBB45/T 235 53—2021 猪主主要病病毒性 性腹泻泻病毒 毒鉴别 别检测测 多重反 多 反 转录聚 转 聚合酶 酶链反应法 Diffferential detect tion of mmajor porcine viral diarrrhea viruses—AA muultiplex RT-PCR 2021 - 08 0 - 31 实施 实 2021 - 07 - 27 发布 发 广西壮 壮族自治区 区市场监督 督管理局 发 布 目 次 — DB45/T 2353 2021 前言 ................................................................................. II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 缩略语 ............................................................................. 2 5 材料准备 ........................................................................... 2 6 操作方法 ........................................................................... 3 6.1 操作环境 ....................................................................... 3 6.2 待检样品处理 ................................................................... 3 6.3 待检样品总 RNA 提取 ............................................................ 3 6.4 RT 反应 ......................................................................... 3 6.5 PCR 扩增 ........................................................................ 3 6.6 阴性及阳性对照 ................................................................. 4 6.7 扩增产物电泳检测 ............................................................... 4 7 结果判定 ........................................................................... 4 附录 A（规范性） 引物序列、扩增片段及结果判定 ......................................... 6 附录 B（规范性） 重组质粒标准品制备 ................................................... 8 I 前 言 — DB45/T 2353 2021 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由广西壮族自治区农业农村厅提出并宣贯。 本文件由广西畜牧业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心。 本文件起草人：施开创、冯淑萍、尹彦文、陈芳芳、粟艳琼、屈素洁、陆文俊、莫胜兰、李军。 II — DB45/T 2353 2021 猪主要病毒性腹泻病毒鉴别检测 多重反转录聚合酶链反应法 1 范围 本文件规定了采用多重反转录聚合酶链反应法鉴别检测猪主要病毒性腹泻病毒的材料准备、操作方 法、结果判定等要求。 本文件适用于广西行政区域内猪主要病毒性腹泻病毒的鉴别检测。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 3.1 下列术语和定义适用于本文件。 猪主要病毒性腹泻 swine main viral diarrhea 由病毒引起的急性消化道传染病，以厌食、呕吐、腹泻、脱水为主要特征，其主要病原有猪流行性 腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒。 3.2 猪冠状病毒 porcine coronavirus 为有囊膜的单股正链RNA病毒，主要包括猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV） 以及猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）。 3.3 猪轮状病毒 porcine rotavirus，PoRV 3.4 属于呼肠孤病毒科轮状病毒属成员，为双股多节段RNA病毒。 反转录 reverse transcription，RT 3.5 以RNA为模板合成互补脱氧核糖核酸（cDNA）的过程。 聚合酶链反应 polymerase chain reaction，PCR 一种在体外快速扩增特定脱氧核糖核酸（DNA）片段的方法。热变性复性延伸三步反应组成一个循 环，经多次循环反应，使目的DNA得以大量扩增。 3.6 多重聚合酶链反应 multiplex polymerase chain reaction，Multi-PCR 简称多重PCR，是PCR技术的一种形式。同一反应体系中加入多对引物，同时扩增多个模板的PCR技 术。 1 — DB45/T 2353 2021 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PDCoV：猪德尔塔冠状病毒（porcine deltacoronavirus） PEDV：猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus） PoRV：猪轮状病毒（porcine rotavirus） RNA：核糖核酸（Ribonucleic Acid） TGEV：猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus） 5 材料准备 5.1 试剂 5.1.1 特异性引物 引物序列见附录 A 中的表 A.1，上游、下游引物的使用浓度均为25 pmol/µL。 5.1.2 RNA 抽提试剂盒 商 品化的 RNA 抽提试剂盒使用前经技术验证合格。 5.1.3 RT-PCR 试剂盒 商 品化的 RT-PCR 试剂盒使用前经技术验证合格。 5.1.4 电泳缓冲液 商 品化的电泳缓冲液使用前经技术验证合格。 5.2 仪器设备及耗材 5.2.1 仪器设备 下： ——生物安全柜； ——普通 PCR 仪； ——高速台式冷冻离心机； ——漩涡振荡器； ——组织匀浆机或研钵； ——凝胶成像系统； ——微量移液器； ——水平电泳仪。 如 5.2.2 一次性耗材 下： ——乳胶手套； ——Eppendorf(EP)管； ——PCR 管； ——吸头。 如 2 — DB45/T 2353 2021 注： EP管、PCR管、吸头等使用无RNA酶的一次性塑料制品，否则在使用前应经 DEPC水处理，然后用1.034×10 Pa 5 高压灭菌30 min。 6 操作方法 6.1 操作环境 有相应的生物安全设施，按样品处理区、核酸提取区、样品配液区、PCR扩增区、结果观察区等不 同功能分区，各功能区应有专用试剂和实验耗材，不可交叉混用。操作时，应在生物安全Ⅱ级或Ⅱ级以 上防护实验室内且无RNA酶的环境下进行。 6.2 待检样品处理 6.2.1 组织样品 取病猪的小肠组织 1 g～2 g，置于 2.0 mLEP 管中，加入灭菌的 1 mol/L PBS（pH 7.2）1 mL，用组织 匀浆机或研钵充分研磨捣碎组织样品后，反复冻融 3 次；以 10 000×g 离心 5 min，收集上清，用于总 RNA 抽提，或置 -20 ℃保存备用。 6.2.2 肛拭子、粪便拭子样品 将样品置于 2.0 mL EP 管中，加入灭菌的 1 mol/L PBS（pH 7.2）1 mL，在漩涡振荡器上振荡 30 s， 以 10 000×g 离心 5 min，收集上清，用于总 RNA 抽提，或置 -20℃保存备用。 6.3 待检样品总 RNA 提取 取200 µL待检样品于无RNA酶的1.5 m灭菌EP管中，按照RNA提取试剂盒操作说明书提取总RNA。 6.4 RT 反应 反应液总量 20 µL，在冰浴条件下，在 PCR 反应管中按下列用量分别加入各成分： ——5×RT 缓冲液 4 µL； ——AMV 反转录酶（5 U/µL）0.5 µL； ——dNTP 混合物（各 10 mM/L）1 µL； ——RNA 酶抑制剂（40 U/µL）0.5 µL； ——随机引物 6 聚体（50 pmol/µL）1.5 µL； ——样品总 RNA 模板：5 µL； ——灭菌双蒸水：7.5 µL。 6.4.2 加完试剂后立即离心混匀。将 PCR 管置于 PCR 仪内进行反转录，获得 cDNA 直接用于多重 PCR 扩增，或置-20℃保存备用。反应程序如下： a) 30℃保温 10 min； b) 45℃反转录 30 min； c) 95℃反转录酶失活反应 5 min； d) 4℃保温 5 min。 6.4.1 6.5 PCR 扩增 反转录后，以获得的 cDNA 为模板建立 50 µLPCR 反应体系。在冰浴条件下，按下列用量在 PCR 管中分别加入以下成分： 6.5.1 3 — ——2×TaqPCR MasterMix25 µL； ——PEDV-N 上、下游引物（25 pmol/µL）各 1 µL； ——TGEV-M 上、下游引物（25 pmol/µL）各