ICS 65.020.30 CCS B 44 44 广 东 省 地 方 标 准 DB44/T 2337—2021 实验动物 病原菌 PCR 定性分析 Laboratory animals Qualitative analysis of pathogenic bacteria with polymerase chain reaction method 2021 - 10 - 18 发布 2022 - 01 - 18 实施 广东省市场监督管理局 发 布 DB44/T 2337—2021 目 次 前言 ................................................................................. II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 缩略语 ............................................................................. 1 5 原理 ............................................................................... 2 6 主要设备和材料 ..................................................................... 2 7 试剂 ............................................................................... 2 8 方法 ............................................................................... 3 9 结果 ............................................................................... 6 10 防止交叉污染的措施 ................................................................ 7 附录 A（规范性） 溶液的配制 ........................................................... 8 附录 B（规范性） 引物及探针序列 ...................................................... 10 参考文献 ............................................................................. 13 I DB44/T 2337—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由广东省科学技术厅提出并组织实施。 本文件由广东省实验动物标准化技术委员会（GD/TC 93）归口。 本文件起草单位：广东省实验动物监测所。 本文件主要起草人：闵凡贵、潘金春、黄树武、王静、袁文、何丽芳、陈梅玲、张钰、黄韧。 II DB44/T 2337—2021 实验动物 病原菌 PCR 定性分析 1 范围 本文件规定了实验动物病原菌的PCR定性分析方法。 本文件适用于实验动物病原菌核酸定性分析。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14926 实验动物 微生物检测方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction，PCR 体外酶催化合成特异DNA片段的方法，模板DNA先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的 反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而相 互结合，接着在DNA 聚合酶的作用下以四种dNTP为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和 延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。 实时荧光聚合酶链式反应 real-time PCR，实时荧光 PCR 实时荧光PCR方法是在普通PCR的基础上，在反应体系中加入特异性荧光探针，利用荧光信号积累实 时报告整个PCR进程，通过读取每次循环反应中的荧光发射信号，间接反映了PCR扩增的目标基因的量， 最后通过扩增曲线对未知模板进行定性或定量分析。 Ct 值 cycle threshold 实时荧光PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） EDTA 乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid） 1 DB44/T 2337—2021 PBS 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline） RNA 核糖核酸（ribonucleic acid） TAE 三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸缓冲液（tris-acetate-EDTA） 5 原理 用合适的方法提取样本中的DNA，分别针对病原菌16s RNA或其他保守的基因设计特异的引物探针 序列，通过PCR对模板进行扩增，根据PCR反应结果分析该样品中是否含有某种病原菌。 6 主要设备和材料 PCR 仪。 实时荧光 PCR 仪。 电泳仪。 凝胶成像分析系统。 高速冷冻离心机。 普通离心机。 恒温孵育器。 漩涡振荡器。 组织匀浆器。 微量核酸定量仪。 生物安全柜。 PCR 超净工作台。 冰箱（-20 ℃）。 微量移液器：0.1 µL～2 µL，1 µL～10 µL，10 µL～100 µL，100 µL～1000 µL。 灭菌离心管（1.5 mL、2 mL、5 mL、15 mL），灭菌吸头（10 µL，200 µL，1 mL），灭菌 PCR 扩 增反应管（0.2 mL，八连管或 96 孔板）。 聚乙烯薄膜袋：90 mm×150 mm 自封袋，使用前紫外灭菌 20 min。 采样工具：剪刀、镊子和灭菌棉拭子等。 7 试剂 以下所用的试剂除特别注明者外均为分析纯，所用的水为双蒸水或去离子水，应符合 GB/T 6682 所规定一级水的要求。所有涉及分子生物学操作的水均为无 DNA 酶、无 RNA 酶水。 灭菌 PBS。配制方法见附录 A。 DNA 抽提试剂：基因组 DNA 提取试剂盒 DNeasy Blood & Tissue Kit 或其他类似产品。 注： DNA提取试剂盒是由Qiagen公司提供的DNeasy Blood & Tissue Kit。给出这一信息是为了方便本文件使用者， 并不表示对这一产品的认可。亦可使用其他类似的DNA提取试剂盒进行。 无水乙醇。 TM PCR 试剂：Premix Taq （Version 2.0 plus dye）、Premix Ex Taq™ （Probe qPCR）或其他类 似产品。 2 DB44/T 2337—2021 注： 以上PCR试剂是是由Takara公司提供的商品试剂盒，是本文件适合的市售产品的使用实例，给出这一信息是为 了方便本文件使用者，并不表示对这一产品的认可。亦可使用其他类似的PCR试剂。 DNA 相对分子质量标准：100 bp～2 000 bp。 50×TAE 电泳缓冲液，配制方法见附录 A。 溴化乙锭：10 mg/mL，配制方法见附录 A，或其他类似产品。 1.5%琼脂糖凝胶，配制方法见附录 A。 引物和探针：根据附录 B 中表 B.1 和表 B.2 的序列合成引物和探针，引物和探针加入无 DNA 酶、 无 RNA 酶水配制成 10 µmol/L 储备液，置于-20 ℃保存，使用的工作液应当置于 4 ℃存放，避免引物 或探针由于反复冻融出现降解。 8 方法 生物安全措施 对于可能潜在人兽共患病的样本，应在生物安全二级及以上实验室进行操作，采样应在生物安全柜 中进行。实验操作及处理按照GB 19489的规定，由具备相关资质的工作人员进行相应操作。 采样及样本的处理 采样过程中样本不得交叉污染，采样及样本前处理过程中须戴一次性手套。采样及样本处理过程操 作人员应做好个人防护。 8.2.1 脏器组织 剖检，无菌采集动物脏器，剪取待检样本0.5 g～2 g，加入5倍体积灭菌PBS，使用匀浆器充分匀浆 1 min～2 min，然后将组织悬液在4 ℃，8 000 g离心10 min，取上清液转入另一无菌5 mL离心管中， 编号备用。 8.2.2 细菌培养物 2 2 参照国标GB/T 14926对临床样本进行细菌分离培养，获得可疑阳性培养物，刮取约1 mm ～3 mm 菌 苔，加入500 µL无菌水混匀，煮沸后，8 000 g离心1 min，取上清液直接进行PCR。 8.2.3 盲肠内容物或粪便 无菌采集动物盲肠内容物或粪便，取待检样本0.5 g～2.0 g，加入5倍体积灭菌PBS，使用匀浆器充 分匀浆1 min～2 min，8 000 g离心5 min，取上清液取离心上清液转入另一无菌离心管中，编号备用。 8.2.4 血液样本 无菌采集动物血液0.2 mL～0.5 mL，加入柠檬酸钠或EDTA抗凝管中，轻轻颠倒混匀3次～5次，编号 备用。 8.2.5 拭子取样 对活体动物取样可采集肛拭子、咽喉拭子、泄殖腔拭子、鼻拭子、皮肤拭子等，浸泡于3 mL无菌PBS 中5 min～10 min，充分混匀后，4 ℃，8 000 g离心5 min，取上清液转入