(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211165818.X (22)申请日 2022.09.23 (71)申请人 华东理工大 学 地址 200237 上海市徐汇区梅陇路13 0号 申请人 上海紫邦生物医药有限公司 (72)发明人 郭美锦　杜林晓　刘泽波　管书旺　 林立新　 (74)专利代理 机构 苏州荣谷知识产权代理事务 所(普通合伙) 32612 专利代理师 韩国辉 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 5/04(2006.01) C12P 7/62(2022.01) C12R 1/38(2006.01) (54)发明名称 一种利用红花细胞生产绿原酸类物质的生 物诱导子及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明涉及植物细胞培养技术领域， 公开一 种利用植物细胞培养技术结合新型诱导子高效 生产绿原酸类物质的方法。 主要用到的植物细 胞： 红花(Carthamus  tinctorius  L.)悬浮细胞。 其步骤包括： 新型诱导子的制备、 新型诱导子的 添加、 绿原酸类物质的高效合成、 产物的提取与 鉴定。 本发 明采用添加新型诱导子—灭活的脱氮 假单胞菌(Pseudomonas  denitrificans)， 并进 一步利用植物细胞液体发酵提高红花悬浮细胞 内绿原酸类物质的含量， 操作简单， 原料制备高 效、 后处理污染少， 绿原酸类提取物质接近植株 含量水平。 本发 明提供的绿原酸类提取物具有优 异的抗氧化、 抗炎的功能， 可为药用或护肤品添 加剂奠定 基础。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 115354004 A 2022.11.18 CN 115354004 A 1.一种利用红花细胞生产绿原酸类物质的生物诱导子， 为灭活的脱氮假单胞菌 (Pseudomo nas denitrificans)。 2.权利要求1所述的生物诱 导子的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)菌种活化 取保藏于 ‑80℃低温的菌株脱氮假单胞菌菌丝体接种到经无菌处理的固体培养基斜面 上， 28℃培养3天进行菌种活化； 所述固体培养基的组成为： 可溶性淀粉10g/L， 磷酸二氢钾 1g/L， 硫酸镁1g/L， 氯化钠1g/L， 硫酸铵2g/L， 碳酸钙2g/L， 硫酸亚铁0.001g/L， 七水硫酸锌 0.001g/L， 酵母提取物0.5g/L， 蛋白胨1g/L， 琼脂20g/L， pH通过NaOH控制在7.2， 并预先在 115℃条件下灭菌25mi n； (2)诱导子脱氮假单 胞菌摇瓶培 养 从所述斜面上洗下菌丝体接入液体培养基中， 260rpm， 32℃培养28h； 所述液体培养基 的组成为： 蔗糖40g/L， 玉米浆20g/L， 甜菜碱5g/L， 硫酸铵1g/L， 磷酸氢二铵2g/L， 一水硫酸 锰0.8g/L， 六水氯化钴0.02g/L， 氧化镁0.5g/L， DMBI  0.05g/L， 七水硫酸锌0.08g/L， 碳酸钙 1g/L， pH通过NaOH控制在7.2， 并预 先在115℃条件下灭菌25mi n； (3)诱导子制备 取步骤(2)所得菌丝体进行研磨， 所得菌体用磷酸缓冲液PBS溶液溶解， 将得到混合液 在121℃条件下灭菌25mi n。 3.权利要求1所述的灭活的脱氮假单胞菌(Pseudomonas  denitrificans)用于红花悬 浮细胞生产绿原酸类物质。 4.权利要求1所述的灭活的脱氮假单胞菌(Pseudomonas  denitrificans)用于红花悬 浮细胞生产绿原酸类物质， 其特征在于， 将红花悬浮细胞培养6天， 在无菌条件 下， 将100mg/ L的脱氮假单 胞菌加入培 养基中， 26℃， 1 15rpm转速下振荡培 养3天。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115354004 A 2一种利用红花细胞生产绿原酸类物质的生物诱导子及其制备 方法和应用 技术领域 [0001]本发明涉及 植物细胞培养技术领域， 具体涉及一种利用红花细胞生产绿原酸类物 质的生物诱 导子及其制备 方法和应用。 背景技术 [0002]绿原酸类物质普遍存在于植物当中， 在金银花、 杜仲、 菊花、 咖啡、 栀子等植物中含 量丰富， 目前绿原 酸主要从野生植物中提取。 虽然植物是一种可再生资源， 但 植株生长速度 慢、 栽培困难、 有效成分含量低且易受到地理、 季节、 环 境变化等诸多因素的影响， 从而使得 从野生植物资源中提取有效成分收到限制， 因此需要一种可代替的生产方式。 [0003]植物细胞悬浮培养， 是指将植物组织或小的细胞聚集体接种于液体培养基中， 并 进行振荡培养的过程。 其通常挑取植物生长迅速、 疏松、 状态优良的愈伤组织进行悬浮培 养， 并通过类似于微生物发酵的悬浮培养手段， 在短时间内获得大量的生长状态良好的植 物细胞， 添加诱导子从而获得可观产量的有效次级代谢产物， 比如绿原酸类。 因其周期短、 可控性强、 受自然 条件影响小、 操作方便、 重复性好、 易于工业化生产等诸多优点， 已被理想 化应用于一些重要生物活性物质和自然产物的小规模生产。 [0004]诱导子可分为生物诱导子与非生物诱导子两种。 生物诱导子包括来自真菌、 细菌 或草食动物诱导子、 植物细胞壁碎片、 植物被病原体或草食动物入侵时释放的化学物质等， 其功能与受体偶联， 通过激活或抑制某些酶或离子通道起作用。 非生物诱导子是指本身并 不是植物细胞中的天然成分， 却可以通过化学或物理途径使植物产生防御反应， 进而触发 植物次生活性物质的合成。 其种类主要包括植物生长调节剂、 水杨酸、 茉莉酸甲酯、 重金属 盐、 稀土元 素等。 [0005]本发明是采用新型诱导子脱氮假单胞菌与植物细胞悬浮培养技术相结合， 从而找 到一种高效生物合成绿原酸类物质的方法。 发明内容 [0006]本发明的目的是为了开发出一种新型诱导子， 利用植物细胞培养技术生产绿原酸 类物质的方法， 解决传统植株生长周期长、 原料资源短缺、 受环境影响大、 长期依靠茉莉酸 甲酯(MeJA)、 水杨酸 等诱导次级代谢产物的问题。 [0007]本发明的技 术方案为： [0008]一种利用红花细胞生产绿原酸类物质的生物诱导子， 为灭活的脱氮假单胞菌 (Pseudomo nas denitrificans)。 [0009]其制备方法是： [0010](1)菌种活化 [0011]挑取保藏于 ‑80℃低温低温冰箱中的菌株脱氮假单胞菌(Pseudomonas   denitrificans)菌丝体接种到经无菌处理的固体培养基斜面上， 28℃培养3天进行菌种活说　明　书 1/5 页 3 CN 115354004 A 3