(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211255294.3 (22)申请日 2022.10.13 (71)申请人 艾美卫信生物药业 （浙江） 有限公司 地址 315600 浙江省宁波市宁海县科技工 业园区竹泉路2 9号 (72)发明人 朱楠　马伟　 (74)专利代理 机构 北京维正专利代理有限公司 11508 专利代理师 石芳 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12P 19/04(2006.01) A61K 35/407(2015.01) A61P 1/16(2006.01) C12R 1/36(2006.01) (54)发明名称 一种脑膜炎球菌发酵培养方法、 发酵液、 精 制多糖、 应用 (57)摘要 本申请涉及生物工程的领域， 尤其是涉及一 种脑膜炎球菌发酵培养方法、 发酵液、 精制多糖、 应用。 脑膜炎球菌发酵培养方法， 包括以下步骤： S1、 液体复苏培养开启菌种， 接种于脑膜炎球菌 培养基， OD600达到0.6～1.0时， 结束培养； S2、 液 体摇瓶培养将一代液体培养菌液接种于脑膜炎 球菌培养基中， OD600达到1.0～2.0时， 结束培养； S3、 发酵培养将二代液体培养菌液接种于脑膜炎 球菌培养基中进行发酵， 控制发酵环境为弱酸 性， 溶氧在2 0%～40%， 菌种生长进入稳定期， 结束 培养。 本申请通过液体复苏传代的模式， 减少半 综合培养基羊血成分的引入， 提高了疫苗安全 性； 同时， 减少了发酵培养时间， 便于监测并控制 传代菌液浓度。 权利要求书1页 说明书10页 CN 115478034 A 2022.12.16 CN 115478034 A 1.一种脑 膜炎球菌发酵培 养方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： S1、 液体复苏培 养 开启菌种， 接种于脑膜炎球菌培养基， OD600达到0.6～1.0时， 结束培养， 得到一代液体 培养菌液； S2、 液体摇瓶培 养 将一代液体培养菌液接种于脑膜炎球菌培养基中， OD600达到1.0～2.0时， 结束培养， 得 到二代液体培 养菌液； S3、 发酵培 养 将二代液体培养菌液接种于脑膜炎球菌培养基中进行发酵， 控制 发酵环境为弱酸性， 溶氧在20%～40%， 菌种生长进入稳定期， 结束培 养。 2.根据权利要求1所述的脑膜炎球菌发酵培养方法， 其特征在于： 步骤S1和/或S2中的 培养条件包括温度37 ±3.5℃， 转速20 0～400rpm培养3～12小时。 3.根据权利 要求1或2所述的脑膜炎球菌发酵培养方法， 其特征在于： 步骤S1和/或S2中 的培养条件包括控制培 养环境为酸性。 4.根据权利要求3所述的脑膜炎球菌发酵培养方法， 其特征在于： 控制培养pH为6.5～ 6.8。 5.根据权利要求1所述的脑膜炎球菌发酵培养方法， 其特征在于： 步骤S3中， 将二代液 体培养菌液接种于脑膜炎球菌培养基中进行发酵， 控制pH为6.8～7.4， 培养3～12h后， 控制 pH在6.3～7.0， 溶 氧在18%～44%， 菌种生长进入稳定期， 结束培 养。 6.根据权利要求 4或5所述的脑 膜炎球菌发酵培 养方法， 其特 征在于： 采用弱酸控制pH 。 7.根据权利要求6所述的脑 膜炎球菌发酵培 养方法， 其特 征在于： 所述弱酸 为冰醋酸。 8.采用权利要求1 ‑7任一项所述的发酵培 养方法制备的脑 膜炎球菌发酵 液。 9.由权利要求8所述的脑 膜炎球菌发酵发酵 液制备的精制多糖。 10.由权利要求9所述的脑膜炎球菌精制多糖所制备的脑膜炎球菌多糖疫苗或结合疫 苗。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115478034 A 2一种脑膜炎球菌发酵培养方 法、 发酵液、 精制多糖、 应用 技术领域 [0001]本申请涉及生物工程的领域， 尤其是涉及一种脑膜炎球菌 发酵培养方法、 发酵液、 精制多糖以及应用。 背景技术 [0002]脑膜炎球菌性脑膜炎(meningococcalmeningitis)又称流行性脑脊髓膜炎 (Neisseriameningitides， NM)， 简称流脑， 是由奈瑟氏脑膜炎球菌引起的一种严重危害人 类健康的呼吸道传染病。 [0003]根据荚膜多糖在化学和血清学上的不同， 脑膜炎球菌分为若干群， 其中A、 C、 Y、 W135群是常见的致病菌。 在当今世界儿童传染病的防治目标中， 流脑的免疫预防仍然是重 要课题之一。 [0004]目前， 采用半综合培养基为固体复苏传代模式， 其缺点有: ①现有技术一代固体半 综合培养基含有羊血， 引入了动物源性成分， 从疫苗的安全性角度来考虑， 非必要不提倡， 尽量不使用； ②固体培养耗时， 一般需要8 ‑16个小时； ③固体培养的终点， 不像液体培养般 可即时监测OD值， 不方便控制传代菌浓度。 [0005]另外， 如何在现有技术基础上， 不断突破提高产量， 降低生产成本， 也是疫苗行业 所不断追求的。 因此目前亟需一种更高产量的脑 膜炎球菌发酵培 养方法。 发明内容 [0006]为了提升脑膜炎球菌荚膜的多糖产量， 本申请提供一种脑膜炎球菌发酵培养方 法。 [0007]本申请提供的一种脑 膜炎球菌发酵培 养方法,采用如下的技 术方案： 第一方面， 本申请提供一种脑 膜炎球菌发酵培 养方法， 包括以下步骤： S1、 液体复苏培 养 开启菌种， 接种于脑膜炎球菌培养基， OD600达到0.6～1.0时， 结束培养， 得到一代 液体培养菌液。 [0008]S2、 液体摇瓶培 养 将一代液体培养菌液接种于脑膜炎球菌培养基中， OD600达到1.0～2.0时， 结束培 养， 得到二代液体培 养菌液。 [0009]S3、 发酵培 养 将二代液体培养菌液接种于脑膜炎球菌培养基中进行发酵， 控制发酵环境为弱酸 性， 溶氧在20％～40％， 菌种生长进入稳定期， 结束培 养。 [0010]通过采用上述方案： 本申请通过控制传代培养模式的接种比例， 并结合本申请特 有的发酵培养模式， 可使脑膜炎球菌在液体摇瓶培养时， 在弱酸环境下， 产生荚膜多糖含量 更高的种子液。 再通过在发酵过程中控制脑膜炎球菌的在特定的培养环境， 使得发酵形成 更多的荚膜多糖， 从而达 到提高多糖产量。说　明　书 1/10 页 3 CN 115478034 A 3