(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211328474.X (22)申请日 2022.10.26 (71)申请人 南京大学 地址 210000 江苏省南京市栖霞区仙林大 道163号 申请人 江苏南创化学与生命健康研究院有 限公司 (72)发明人 魏炜　陈子鹏　赵钰沁　颜莉　 赵劲　 (74)专利代理 机构 无锡华源专利商标事务所 (普通合伙) 32228 专利代理师 冯智文 (51)Int.Cl. C12P 3/00(2006.01) C12N 1/20(2006.01)C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 高聚磷酸盐及一步法发酵生产高聚磷酸盐 的方法 (57)摘要 本发明公开了一种高聚磷酸盐及一步法发 酵生产高聚磷酸盐的方法， 属于高聚磷酸盐生产 技术领域。 本发明所述方法包括如下步骤： 从长 有弗氏柠檬酸杆菌的LB平板上挑取单克隆至种 子培养基， 得到种子培养液， 将种子培养液接种 于磷聚培养基进行发酵， 制得发酵液； 收集发酵 液离心、 过滤得到菌泥、 将菌泥冻干、 碳化、 研磨、 灰化、 用氯化锂溶解灰化产物、 离心、 收集上清 液， 冻干得到高聚磷酸盐。 本发明所述制备工艺 流程无需高温或高压装置设备， 制备工艺流程简 单， 降低了生产成本、 生产步骤少 、 缩短了发酵周 期、 提高了菌体的聚磷速度和聚磷量以及高聚磷 酸盐产量。 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 CN 115521945 A 2022.12.27 CN 115521945 A 1.一步法发酵生产高聚磷酸盐的方法， 其特 征在于， 所述方法包括如下步骤： (1)从长有弗氏柠檬酸杆菌的LB平板上挑取单克隆至种子培养基， 得到种子培养液， 将 种子培养液接种于磷聚培 养基进行发酵， 制得发酵 液； (2)收集步骤(1)的发酵液， 并进行离心、 过滤得到菌泥、 将得到的菌泥进行冻干、 碳化、 研磨、 灰化、 用氯化锂 溶解灰化产物、 以≥12000rpm的速度离心10～15min、 收集上清液， 于 ‑ 75～‑80℃冻干 5～6h， 得到高聚磷酸盐。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述LB平板含有20～25mg/mL 卡那霉素； 所述种子培养基成分为每升包括： 胰蛋白胨5～6g， 氯化钠0.35～10g， 酵母粉18 ～20g， 工业葡萄糖1～ 2g， 卡那霉素20～ 25mg。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述种子培养液的具体制备方 法为： 挑取单克隆， 接种至100～150mL种子培养基中， 于35～ 37℃， 180～200rpm过夜培养12 ～13h。 4.根据权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述发酵的具体过程为： 以6～ 8％的接种量将种子培养液接种于2.5L磷聚培养基， 使得初始OD600为0.25～0.3， 进行发 酵。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述发酵的条件为： 发酵温度 35～37℃， 初始转速200～ 300r/min， 溶氧浓度为30％， 进气比为1： 1， pH值为7.0， 发酵时间4 ～12h。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述磷聚培养基成分为每升包 括： 蔗糖1.5～2g， 氯化铵0.18～2g； 胰蛋白胨0.1～0.7g； 酵母粉0.1～0.2g； 三水磷酸氢二 钾0.5～1.776g； 氯化钠0.05～0.35g； 七水硫酸镁0.236～1.652g； 磷聚培养基的含磷量为 60～210mg/L。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述离心的速度为6000～ 8000r/min， 时间为5～10mi n。 8.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述冻干的具体过程为： 将菌 泥于‑80～‑75℃冷冻5～6 h后， 置于真空冻干 机冻干1～3天。 9.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述碳化是将冻干后的菌泥于 ≥700℃烧制1h； 所述灰化的具体过程为将研磨的产物于≥700℃灰化1h后， 经搅拌后再于 ≥700℃再次灰化0.5 h。 10.一种权利要求1 ‑9任一项所述方法制备的高聚磷酸盐。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115521945 A 2高聚磷酸盐及 一步法发酵生产高聚磷酸盐的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及高聚磷酸盐生产技术领域， 特别涉及高聚磷酸盐及 一步法发酵生产高 聚磷酸盐的方法。 背景技术 [0002]高聚磷酸盐(Polyp hosphate)是一种由正磷酸盐残基与高能磷氧键组成的结构最 为紧凑的生物大分子， 是一种广泛存在于生物体胞内的、 进化上高度保守的储能高分子材 料。 虽然化学合成法仍是目前高聚磷酸盐 的主流制备方法， 即将磷酸与氨气在200350℃熔 融聚合得到高聚磷酸盐成品(链长<20Pi)， 但也有生物合成聚合度更高(20Pi<链长< 700Pi)、 单位负电荷 密度更高、 更 具功能性与特 征性的高聚磷酸盐的方法。 [0003]目前已报道的在好氧条件下可以生产高聚磷酸盐的细菌有： 积磷小月菌工程菌 (CN 105368838  A)、 约氏不动杆菌(CN  109022328  A)、 转基因聚球藻(CN  106916775A)、 弗 氏柠檬酸杆菌(CN  104531599  B)， 但以上专利中均未说明高聚磷酸盐的聚合度以及如何从 菌液中分离出高聚磷酸盐。 CN  103687582  B报道了从酵母细胞中可以通过抽提得到聚合度 在20300的高聚磷酸盐混合产物， 但不能将酵母细胞内蛋白质或其他内毒素成分同高聚磷 酸盐产品分离 。 [0004]近期， CN 112322664  B公开了一种以弗氏柠檬酸杆菌ATCC  8090为宿主， 通过导入 了宿主自身的多聚磷酸盐激酶编码 基因Ppk1生产高聚合度多聚磷酸盐的方法， 但制备工艺 耗时长达35h以上， 需要先在发酵罐中进行10 ‑16h的高密度 发酵， 发酵后离心收集的菌泥， 再放入序批式生物反应器培养16  19h后获得含高聚磷酸盐产品的菌液， 且每克菌体干重中 仅含有140mg的高聚磷酸盐。 此外， CN  113073121  A公开了一种含高聚合度多聚磷酸盐的纳 米碳材料及高聚合度多 聚磷酸盐 的制备方法， 但需先在生物反应器中曝气培养15  30h， 再 经生物反应 器中PVDF平板膜元件 浓缩1 2h得到发酵 液， 制备工艺 耗时也长 达30h以上。 [0005]高聚磷酸盐作为天然高能产物的代表， 但是经济、 环保、 高效、 简洁制备高聚磷酸 盐的生物发酵生产方法还未 形成生产规模。 发明内容 [0006]针对现有技术的不足， 本发明提供了高聚磷酸盐及一步法发酵生产高聚磷酸盐的 方法。 本发 明所述制备工艺流程无需高温或高压装置 设备， 制备工艺流程简单， 降低了生产 成本、 生产步骤少、 缩短了发酵周期、 提高了菌体的聚磷速度和聚磷量(发酵周期缩短)以及 高聚磷酸盐产量(单位菌体磷 含量)。 [0007]本发明的技 术方案如下： [0008]一步法发酵生产高聚磷酸盐的方法， 包括如下步骤： [0009](1)从长有弗氏柠檬酸杆菌的LB平板上挑取单克隆至种子培养基得到种子培养 液， 将种子 培养液接种于磷聚培 养基进行发酵， 制得发酵 液； [0010](2)将步骤(1)的发酵液进行收集， 并进行离心、 过滤得到菌泥、 将得到的菌泥进行说　明　书 1/7 页 3 CN 115521945 A 3