(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210016053.7 (22)申请日 2022.01.07 (71)申请人 河南省农业科 学院 地址 450002 河南省郑州市金 水区花园路 116号 (72)发明人 滕蔓　罗俊　张文凯　刘金玲　 郑鹿平　罗琴　邢广旭　赵东　 柴书军　张改平　 (74)专利代理 机构 郑州市华翔专利代理事务所 (普通合伙) 41122 代理人 张爱军 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种鉴别不同血清型马立克病病毒感染与 免疫的多重PCR引物、 方法及应用 (57)摘要 本发明提供一种鉴别不同血清型马立克病 病毒感染与免疫的多重PCR引物、 方法及应用。 所 述多重PCR引物组合物包括： 引物对Meq ‑9F、 Meq‑ 11R， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.1、 SEQ  ID NO.2所 示， 扩增MDV ‑1流行毒株的S ‑meq基因和弱毒疫 苗 株的L‑meq基因； 引物对SB ‑1‑1F、 SB‑1‑1R， 核苷 酸序列如SEQ  ID NO.3、 SEQ  ID NO.4所示， 扩增 MDV‑2疫苗株的gB基因； 引物对SB ‑1‑1F、 HVT‑8R， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.3、 SEQ  ID NO.5所示， 扩增HVT疫苗株的gB基因。 权利要求书2页 说明书10页 序列表1页 附图5页 CN 114317827 A 2022.04.12 CN 114317827 A 1.一种鉴别不同血清型马立克病病 毒感染与免疫的多重PCR引物 组合物， 其特征在于， 所述多重PCR引物组合物包括： 引物对Meq ‑9F、 Meq‑11R， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.1、 SEQ ID NO.2所示； 引物对SB ‑1‑1F、 SB‑1‑1R， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.3、 SEQ ID NO.4所示； 引物对SB ‑1‑1F、 HVT‑8R， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.3、 SEQ ID NO.5所示； 所述引物对Meq ‑9F、 Meq‑11R扩增MDV ‑1流行毒株的S ‑meq基因和弱毒疫苗株的L ‑meq基 因； 引物对SB ‑1‑1F、 SB‑1‑1R扩增MDV ‑2疫苗株的gB基因； 引物对SB ‑1‑1F、 HVT‑8R扩增HVT疫 苗株的gB基因。 2.一种鉴别不同血清型马立克病病毒感染与免疫的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒 含有如权利要求1所述的多重PCR引物组合物。 3.如权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还包括阳性标准质粒、 PCR反应 预混液和ddH2O； 所述阳性标准质粒包括pMD19 ‑T‑S‑meq、 pMD19 ‑T‑L‑meq、 pMD19 ‑T‑SB‑1gB 和pMD19‑T‑HVTgB； 所述阳性标准质粒的构建方法为： 以pMD19 ‑T为载体， 分别构建MDV ‑1超强毒株Md5的S ‑ meq基因、 MDV ‑1疫苗株CVI988/Ri spens或疫苗株814的L ‑meq基因、 MDV ‑2疫苗株SB‑1的gB基 因、 HVT疫苗株FC ‑126的gB基因的阳性质粒。 4.如权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述PCR反应预混液为2 ×Easy PCR  SuperMix(+dye)。 5.一种鉴别不同血清型马立克病病 毒感染与免疫的多重PCR检测方法， 其特征在于， 包 括以下步骤： (1)提取待检样品的DNA模板； (2)以阳性标准质粒为对照， 根据权利要求1所述的多重PCR引物组合物进行PCR扩增； (3)待检样品的结果 鉴定。 6.如权利要求5所述的多重PCR检测方法， 其特征在于， 所述PCR反应体系为20μL， 包括 PCR反应预混液10 μL、 10 μM的Meq ‑9F引物0.5 μL、 10 μM的Meq ‑11R引物0.5 μL、 10 μM的SB ‑1‑1F 引物0.25 μL、 10 μM的SB ‑1‑1R引物0.25 μL、 10 μM的HVT ‑8R引物0.25 μL、 待检样品DNA或阳性标 准质粒1 μL， 余 量为ddH2O。 7.如权利要求6所述的多重PCR检测方法， 其特征在于， 所述阳性标准质粒中pMD19 ‑T‑ L‑meq、 pMD19 ‑T‑S‑meq、 pMD19 ‑T‑SB‑1gB、 pMD19 ‑T‑HVTgB的浓度均为10ng/ μL， pMD19 ‑T‑L‑ meq﹕pMD19 ‑T‑S‑meq﹕pMD19 ‑T‑SB‑1gB﹕pMD19 ‑T‑HVTgB的体积比为10﹕ 10﹕ 1﹕ 1； 所述待检样 品DNA的浓度为10ng/ μL。 8.如权利 要求5所述的多重PCR检测方法， 其特征在于， 所述PCR反应程序为94℃预变性 4min； 94℃变性3 0s， 60℃退火3 0s， 72℃延伸1.5mi n， 共30个循环； 72℃延伸5mi n。 9.如权利要求5所述的多重PCR检测方法， 其特 征在于， 所述结果 鉴定的具体方法为： (1)扩增阳性标准质粒时， 扩增得到大小分别为1558bp、 1381bp、 789bp和483bp的4个特 异性条带， 分别指示MDV ‑1疫苗株CVI988/Rispens或疫苗株8 14的L‑meq基因、 MDV ‑1流行毒 株的S‑meq基因、 HVT疫苗株FC ‑126的gB基因以及MDV ‑2疫苗株SB ‑1的gB基因， 表示检测系统 正常有效；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114317827 A 2(2)扩增待检样品 的凝胶电泳仅出现1381bp条带 时， 说明待检样品存在MDV ‑1流行毒株 感染， 发病鸡群可诊断为MD病例； (3)扩增待检样品的凝胶电泳出现1558bp条带时， 说明待检样品免疫了MDV ‑1的 CVI988/Rispens疫苗或814疫苗； (4)扩增待检样品的凝胶电泳出现789bp条 带时， 说明待检样品 免疫了HVT疫苗； (5)扩增待检样品的凝胶电泳出现483bp条带时， 说明待检样品免疫了MDV ‑2的SB‑1疫 苗。 10.如权利要求1所述的多重PCR引物组合物在鉴别不同血清型马立克病病 毒感染与免 疫中的应用， 包括但不仅限于临床马立克病例的鉴别诊断、 病毒分离株分型鉴定以及MD疫 苗免疫评价。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114317827 A 3