(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210019352.6 (22)申请日 2022.01.10 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114015795 A (43)申请公布日 2022.02.08 (73)专利权人 湖南菲思特精准医疗科技有限公 司 地址 410000 湖南省长 沙市开福区沙坪 街 道中青路1048号山河医药健康产业园 标准厂房3 栋301-1 (72)发明人 陈立波　孙悦　张元博　 (74)专利代理 机构 湖南乔熹知识产权代理事务 所(普通合伙) 43262 代理人 安曼 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01)(56)对比文件 CN 102952875 A,2013.0 3.06 CN 107338315 A,2017.1 1.10 CN 112501268 A,2021.0 3.16 CN 105420371 A,2016.0 3.23 CN 102229992 A,2011.11.02 CN 111100935 A,2020.0 5.05 WO 201316 3210 A1,2013.10.31 WO 2016174642 A1,2016.1 1.03 US 201210 0546 A1,2012.04.26 US 2021269868 A1,2021.09.02 景奉香等.用DNA芯片快速 检测结核分支杆 菌对利福平的耐药性. 《中华结核和呼吸杂志》 .2001,第24卷(第9期),5 51-554. Xiuqing Ma等.Devel opment of a DNA microarray assay for rapid detecti on of fifteen bacterial pathogens i n pneumo nia. 《BMC Microbi ology》 .2020,第20卷17 7. 审查员 夏向东 (54)发明名称 一种常见病原菌及耐药基因组的焦磷酸检 测试剂盒及其检测方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种常见病原菌及耐药基因 组的焦磷酸检测试剂盒及其检测方法和应用， 其 中， 所述试剂盒用于检测待测样本中12 个耐药菌 菌种及耐药基因， 包括铜绿假单胞菌、 鲍曼不动 杆菌、 金黄色葡萄球菌、 肺炎 克雷伯氏菌、 嗜麦芽 窄食单胞菌、 大肠埃希氏菌、 粪肠球菌、 屎肠球 菌、 KPC基因、 OXA ‑23基因、 SHV基因和M ecA基因的 基因型， 所述试剂盒包括扩增引物组、 测序引物 组、 扩增液、 扩增酶和测序底物。 本发明采用焦磷 酸测序法可同时针对12种高致病性高检出率的 病原菌及耐药基因进行检测， 可随意组合待测病 原菌及耐药基因， 针对不同的环 境进行不同频率 和组合的检测， 检测过程灵活简便， 焦磷酸测序结果快速可读。 权利要求书2页 说明书13页 序列表12页 附图6页 CN 114015795 B 2022.04.01 CN 114015795 B 1.一种常见病原菌及耐药基因组的焦磷酸检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒用于 检测待测样本中12个耐药菌菌种及耐药基因， 包括铜绿假单胞菌、 鲍曼不动杆菌、 金黄 色葡 萄球菌、 肺炎克雷伯氏菌、 嗜麦芽窄食单胞菌、 大肠埃希氏菌、 粪肠球菌、 屎肠球菌、 KPC基 因、 OXA‑23基因、 SHV基因和MecA基因的基因型， 所述试剂盒包括扩增引物组、 测序引物组、 扩增液、 扩增酶和测序底物； 所述扩增引物组包括： 铜绿假单胞菌的扩增引物如序列表SEQ   ID NO.2、 SEQ ID NO.3所示； 鲍曼假单胞菌的扩增引物如序列表SEQ  ID NO.6、 SEQ ID NO.7 所示； 金黄色葡萄球菌的扩增引物如序列表SEQ  ID NO.10、 SEQ  ID NO.11所示； 肺炎克雷伯 氏菌的扩增引物如序列表SEQ  ID NO.14、 SEQ  ID NO.15所示； 嗜麦芽窄食单胞菌的扩增引 物如序列表SEQ  ID NO.18、 SEQ  ID NO.19所示； 大肠埃希氏菌的扩增引物如序列表SEQ  ID  NO.22、 SEQ  ID NO.23所示， 粪肠球菌的扩增引物如序列表SEQ  ID NO.26、 SEQ  ID NO.27所 示； 屎肠球菌的扩增引物如序列表SEQ  ID NO.30、 SEQ  ID NO.31所示； KPC基因的扩增引物 如序列表SEQ  ID NO.34、 SEQ  ID NO.35所示； OXA ‑23基因的扩增引物如序列表SEQ  ID  NO.38、 SEQ  ID NO.39所示； SHV基因的扩增引物如序列表SEQ  ID NO.42、 SEQ  ID NO.43所 示； MecA基因的扩增引 物如序列表SEQ  ID NO.46、 SEQ  ID NO.47所示； 所述测序引物组包 括： 铜绿假单胞菌的测序引物如序列表S EQ ID NO.4所示； 鲍曼假单胞菌的测序引物如序列 表SEQ ID NO.8所示； 金黄色葡萄球菌的测序引物如序列表SEQ  ID NO.12所示； 肺炎 克雷伯 氏菌的测序引物如序列表SEQ  ID NO.16所示； 嗜麦芽窄食单胞菌的测序引物如序列表SEQ   ID NO.20所示； 大肠埃希氏菌的测序引物如序列表SEQ  ID NO.24所示， 粪肠球菌的测序引 物如序列表SEQ  ID NO.28所示； 屎肠球菌的测序引物如序列表SEQ  ID NO.32所示； KPC基因 的测序引物如序列表SEQ  ID NO.36所示； OXA ‑23基因的测序引物如序列表SEQ  ID NO.40所 示； SHV基因的测序引物如序列表SEQ  ID NO.44所示； MecA 基因的测序引物如序列表SEQ  ID  NO.48所示。 2.根据权利要求1所述的常见病原菌及耐药基因组 的焦磷酸检测试剂 盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒反应体系 为25 μL 体系， 反应条件为： 预变性温度设为95℃， 预变性时间设 为5min， 变性 温度设为95℃， 变性时间设为25s， 退火温度设为58℃， 退火时间设为25s， 延伸 温度设为72℃， 延伸时间设为25s， 扩增40个 循环， 72℃保温5mi n。 3.根据权利要求1~2任一项所述的常见病原菌及耐药基因组的焦磷酸检测试剂盒， 其 特征在于， 采用所述试剂盒的检测方法包括如下步骤： a)在洁净的离心管中加入含微珠的结合液40 μL， 再向管中加入PCR产物20 μL，  1100rpm 振荡15mi n； b)将步骤a） 离心管中结合好的混合液， 移液器吹打混匀后， 转移至纯化柱中， 7,000 ×g 离心1min； c)向纯化柱中加入15 0 μL洗涤缓冲液， 7,0 00×g离心 1min； d)取出纯化柱， 向纯化柱中加入2 2 μL稀释后的变性液工作液， 静置 5min； e)取新的洁净离心管， 向离心管中加入退火缓冲液6 μL， 再加入待测序列1 μL； f)将纯化柱插 入离心管中， 7,0 00×g 离心1min， 离心管收集得到单链产物， 弃 纯化柱； g)将 EP 管中的单链产物转移至测序管中， 向每个测序管中加入  3 μL测序酶和  3 μL测 序底物； h)取一个  8排管， 自圆滑一端向平端依次加入dATP、 dTTP、 dGTP、 dCTP、 待测样本对应的权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114015795 B 2待测序列、 d dATP； 将排管底部轻 轻磕碰桌 面， 使得碱基平铺 在排管底部； i)焦磷酸测序。 4.根据权利要求3所述的常见病原菌及耐药基因组 的焦磷酸检测试剂 盒， 其特征在于， 所述PCR产 物的扩增体系中各 组分含量分别为： 待测样 本、 阳性对照或空白对照1 µL， 各上游 引物0.5 μL， 各 下游引物0.5 μL， 扩增酶1 μL和扩增液2 2 μL。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114015795 B 3