(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210028019.1 (22)申请日 2022.01.11 (71)申请人 福州艾迪康医学检验实验室有限公 司 地址 350008 福建省福州市仓山区盖山 镇 阳岐53号3号楼 (72)发明人 陈雪青　王淑一　 (74)专利代理 机构 浙江杭州金通专利事务所有 限公司 3 3100 代理人 黄素萍 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测地中海贫血基因罕见突变的试剂、 方法 和试剂盒 (57)摘要 本发明公开了检测地中海贫血罕见基因突 变的试剂、 方法和试剂盒， 所述试剂包括特异性 扩增α地中海贫血和β地中海贫血罕见基因突 变的正、 反向引物、 内参引物和测序引物； 结合 Sanger测序技术， 快速准确地检测地中海贫血 罕 见基因突变， 有利于明确患者基因型， 在地中海 贫血高发区有助于降低罕见致病突变的漏检率 和减少重症患儿的出生。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图1页 CN 114292908 A 2022.04.08 CN 114292908 A 1.用于检测地中海贫血基因罕见突变的试剂， 其特征在于， 所述试剂包括(1)～(3)中 的至少一种： (1)针对α 地中海贫血相关基因HBA1和HBA 2全序列的第一对引物； (2)针对β 地中海贫血相关基因HB B第1、 2外 显子和部分内含子的第二对引物； (3)针对β 地中海贫血相关基因HB B第3外显子和部分内含子的第三对引物； 其中， 所述第一对引物对的核苷酸序列为SEQ  ID NO： 1和SEQ  ID NO： 2； 所述第二对引物对的核苷酸序列为SEQ  ID NO： 3和SEQ  ID NO： 4； 所述第三对引物对的核苷酸序列为SEQ  ID NO： 5和SEQ  ID NO： 6。 2.如权利要求1所述的试剂， 其特征在于， 还包括测序引物， 其核苷酸序列为SEQ  ID  NO： 7和SEQ  ID NO： 8。 3.如权利要求1所述的试剂， 其特征在于， 还包括(4)检测内参基因actin的引物， 其核 苷酸序列为SEQ  ID NO： 9和SEQ  ID NO： 10。 4.如权利要求1所述的试剂， 其特征在于， (1)、 (2)或(3)中的一对引物浓度均为 0.125uM。 5.如权利要求3所述的试剂， 其特 征在于， 所述内参基因的引物的使用浓度比为1:1。 6.一种检测地中海贫血罕见基因突变的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)抽提待测基因 组DNA； (2)将所述待测基因 组DNA与权利要求1 ‑5之一所述的试剂混合， 进行PCR； (3)利用权利要求2所述的测序引物对(2)中的扩增产物进行测序； (4)将(3)中的测序结果与野生型HBA1、 HBA2和HBB基因序列进行比较， 检测待测基因组 DNA是否有罕见基因突变。 7.如权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 扩增体系内模板DNA浓度最低为0.025ng/uL。 8.一种检测地中海贫血罕见基因突变的试剂 盒， 所述试剂 盒含有试剂， 其特征在于， 所 述试剂包括(1)～(3)中的至少一种： (1)针对α 地中海贫血相关基因HBA1和HBA 2全序列的第一对引物； (2)针对β 地中海贫血相关基因HB B第1、 2外 显子和部分内含子的第二对引物； (3)针对β 地中海贫血相关基因HB B第3外显子和部分内含子的第三对引物； 其中， 所述第一对引物对的核苷酸序列为SEQ  ID NO： 1和SEQ  ID NO： 2； 所述第二对引物对的核苷酸序列为SEQ  ID NO： 3和SEQ  ID NO： 4； 所述第三对引物对的核苷酸序列为SEQ  ID NO： 5和SEQ  ID NO： 6。 9.如权利要求8所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括测序引物， 其核苷酸序列为SEQ  ID  NO： 7和SEQ  ID NO： 8。 10.如权利 要求8所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括(4)检测内参基因actin的引物， 其 核苷酸序列为SEQ  ID NO： 9和SEQ  ID NO： 10。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114292908 A 2检测地中海贫 血基因罕见突变的试剂、 方 法和试剂盒 技术领域 [0001]本发明属基因检测技术领域， 特别涉及检测地中海贫血基因罕见突变 的试剂、 方 法和试剂盒， 采用普通P CR结合Sanger测序技术， 对α 及β 地中海贫血中的罕见型基因突变进 行检测。 背景技术 [0002]地中海贫血(简称地贫)是由于遗传基因缺失或突变所致的慢性溶血性贫血， 一般 可以分为α与β 地贫两大类， 是人类最常见的遗传病之一， 广泛流行于地中海流域、 中东、 东 南亚和非洲。 我国的广西、 广东、 海南、 贵州、 云南、 四川等省是地贫高发区。 α 地贫是由编 码α 珠蛋白链的基因突变导致的地贫， 分为缺 失型和非缺 失型(主要 是点突变)两类， 编 码α 珠蛋 白链的基因位于16号染色体短臂末端(16p  13.3‑pter)的α 珠蛋白基因簇中。 目前全球至少 发现35种缺失型和50多种非缺 失型α 地贫。 β 地贫是由于β 珠蛋白基因突变导致β 珠蛋白链 合 成不足( β+)或缺失( β0)而引起的遗传性 溶血性血红蛋白病， 编码β 珠蛋白基因位于11号染色 体11p15.5上的β 珠蛋白基因簇中。 目前全球己报道了至少200多种基因突变类型， 其中占绝 大多数的点 突变就占190多种， 缺失型有17种。 [0003]全球大约有5％的人口为地贫基因突变的携带者， 目前主流的地贫基因突变检测 试剂盒的范围已能覆盖中 国南方人群α、 β 地贫基因突变的主要类型。 然而， 地贫的分子基础 复杂、 突变类型繁多， 在研究及临床工作中罕见及未知类型时有发现。 地贫的预防和控制已 成为我国卫生系统的重点工作。 目前的常规地中海贫血检测试剂盒往往会造成罕见突变的 漏检,因此在临床 检验中,应严格遵循血液学表型与基因型相结合的原则,当血液学表型与 地中海贫血基因型不相符合时,应该考虑珠蛋白基因测序的方法,以明确是否存在罕见或 新发的地中海贫血突变类型,避免漏诊。 虽然罕见地贫基因型在人群中所占的比例不高， 但 开展罕见地贫突变的检测研究仍然很有必要。 [0004]目前国内外β地贫分子诊断方法主要有等位基因特异性寡核苷酸探针点杂交 (PCR‑ASO)、 反向点杂交(RDB)、 导流杂交和二代测序等。 PCR ‑ASO技术操作繁琐， 通量低和结 果准确性受人为影响大， RDB技术操作繁琐， 通量低、 费用较高以及结果准确性受人为影响 大； 导流杂交技术不能做到基因位点的准确分型； Sanger测序方法成熟可靠， 可检出样 本中 所有已知的突变和未知类型突变， 因此， 本发 明采用PCR扩增结合Sanger测序方法对α 与β 地 中海贫血中的罕见基因突变进行检测。 发明内容 [0005]本发明的目的是提供一种检测地中海贫血基 因罕见突变的试剂和检测方法， 采用 普通PCR结合Sanger测序技术， 可快速准确的检测患者体内海贫血基因罕见突变， 为地中海 贫血的诊断及遗传咨询提供参 考。 [0006]为了实现上述发明目的， 本发明提供了检测地中海贫血基因罕见突变 的试剂， 所 述试剂包括(1)～(3)中的至少一种：说　明　书 1/6 页 3 CN 114292908 A 3