(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210094003.0 (22)申请日 2022.01.26 (66)本国优先权数据 202111669718.6 2021.12.31 CN (71)申请人 上海交通大 学 地址 200240 上海市闵行区东川路80 0号 (72)发明人 朱建国　程曼玲　 (74)专利代理 机构 上海旭诚知识产权代理有限 公司 312 20 代理人 郑立 (51)Int.Cl. C07K 16/12(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/31(2006.01)C12Q 1/6883(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 33/68(2006.01) A61K 39/40(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61P 15/14(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的 单链抗体及其制备方法和用途 (57)摘要 本发明公开了一种牛源抑制金黄色葡萄球 菌溶血功能的单链抗体及其制备方法和用途， 涉 及基因工程领域， 本发明采用RT ‑PCR扩增牛源单 链抗体编码基因的重链可变区VH基因和轻链可 变区VL基因， 利用SOE ‑PCR法， 将linker与VH基因 和VL基因相连构建scFv基因， 该scFv按照VL ‑ Linker‑VH的顺序进行连接， 将其克隆到噬菌粒 载体pCANTAB5E中构建单链抗体初级文库， 辅助 噬菌体M13KO7拯救初级文库， 用原核表达的Hlb 作为包被抗原， 经过四轮的富集淘选后， 采用 phage ELISA方法筛选阳性克隆， 获得的单链抗 体能够特异性的结合金黄色葡萄球菌Hlb， 表现 出明显抑制金黄色葡萄球菌Hlb的溶血活性， 从 而减弱金黄色葡萄球 菌对牛乳腺的致病性。 权利要求书2页 说明书6页 序列表4页 附图2页 CN 114409778 A 2022.04.29 CN 114409778 A 1.一种牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体， 其特征在于， 包括轻链可变区 VL、 重链可变区VH、 连接肽Linker， 并按照VL ‑Linker‑VH的顺序连接构成牛源单链抗体片段 VL‑Linker‑VH， 所述轻链可变区VL氨基酸序列如SEQ  ID No.1所示， 所述重链可变区VH氨基 酸序列如SEQ  ID No.2所示。 2.根据权利要求1所述的牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体， 其特征在于， 所述牛源单链抗体片段VL ‑Linker‑VH氨基酸序列如SEQ  ID No.3所示。 3.一种抑制奶牛乳腺炎的药物， 其特征在于， 该药物包括权利要求1或2所述的牛源抑 制金黄色葡萄球菌溶 血功能的单链抗体。 4.一种用于金黄色葡萄球菌的试剂 盒， 其特征在于包括权利要求1或2的牛源抑制金黄 色葡萄球菌溶血功能的单链抗体， 或编 码所述牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗 体的基因片段以及与之交联的探针。 5.一种牛源抑制金黄色葡萄球菌溶 血功能的单链抗体， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤1、 扩增轻链可变区VL基因和重链可变区VH基因 采用RT‑PCR从患奶牛乳腺炎的外周血单个核细胞RNA中扩增出抗体编码基因的轻链可 变区VL基因和重链可变区VH基因； 步骤2、 合成scFv基因 利用SOE‑PCR法将中间连接肽linker、 VH基因、 VL基因相连， 构建牛源性单链抗体基因， 即scFv基因； 步骤3、 构建重组表达质粒 将scFv基因和噬菌粒 载体酶切后， 构建重组表达质粒； 步骤4、 建立初级单链抗体文库 将重组表达质粒转 化入宿主细胞， 培 养并用辅助噬菌体扩增建立初级单链抗体文库； 步骤5、 用原核表达的金黄色葡萄球菌 Hlb蛋白作为包被抗原， 富 集淘选； 步骤6、 采用phage  ELISA筛选,用原核表达的金黄色葡萄球菌Hlb蛋白作为包被抗原， 筛选阳性克隆； 步骤7、 构建单链抗体原核表达质粒 将筛选得到 的阳性克隆酶切， 回收单链抗体Hlb ‑scFv‑1编码基因， 与同步酶切的原核 表达载体pET32a(+)混匀后， 14～16℃连接过夜， 连接产物转化DH5α 感受态细胞后， 挑取单 克隆， 菌落PCR和质粒双酶切验证正确的克隆进行测序； 步骤8、 构建单链抗体原核表达质粒的菌株 测序正确的克隆进行质粒的提取， 再将重组质粒转化到BL21感受态细胞后， 挑取单克 隆， 菌落P CR和质粒双酶切验证正确的克隆测序， 测序正确的即为构建成的单链抗体原核表 达质粒pET32a ‑Hlb‑scFv‑1； 步骤9、 表达纯化单链抗体蛋白 将步骤8构建成单链抗体原核表达质粒的菌株pET32a ‑Hlb‑scFv‑1‑BL21在37℃培养， 当细菌OD值为0.4～0.6时， 加入0.6mM蛋白质诱导剂IPTG， 在28℃进行诱导表达16～20h后， 对单链抗体蛋白进行 纯化。 6.根据权利要求5所述的牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体的制备方法， 其特征在于， 所述抗体可变区VL和重链可变区VH氨基酸序列如SEQ  ID No.1、 SEQ  ID No.2权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114409778 A 2所示， scFv氨基酸序列如SEQ  ID No.3所示， 轻、 重链的正反 向引物分别为VL  F、 VL R、 VH F 和VH R， 核苷酸序列如SEQ  ID No.4、 SEQ  ID No.5、 SEQ  ID No.6和SEQ ID No.7所示， VLF、 VH R分别含有SfiI和NotI酶切位点， V H F、 VL R含互补的Linker序列， 步骤7中所述菌落PCR 引物分别为VL ‑F、 VH‑R， 核苷酸序列如SEQ  ID No.8和SEQ ID No.9所示。 7.根据权利要求5所述的一种牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体的制备方 法， 其特征在于， 步骤7中， 所述酶切位 点为EcoRI和Xho I。 8.根据权利要求1所述的一种牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体的制备方 法， 其特征在于， 步骤4中， 所述宿主细胞为大肠杆菌TG1细胞。 9.一种原核表达质粒pET32a ‑Hlb‑scFv‑1， 其特征在于， 所述质粒包括牛源抑制金黄色 葡萄球菌溶 血功能的单链抗体的编码基因。 10.一种原核表达菌株pET32a ‑Hlb‑scFv‑1‑BL21， 其特征在于， 所述菌株转染有一种牛 源抑制金黄色葡萄球菌溶 血功能的单链抗体的编码基因。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114409778 A 3