ICS 67.050 CCS X 04 37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 4415—2021 β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鉴定及牛奶中 β-乳球蛋白的检测技术 Detection of β-lactoglobulin gene knockout cow and β-lactoglobulin in cow's milk 2021 - 10 - 18 发布 2021 - 11 - 18 实施 山东省市场监督管理局 发 布 DB 37/T 4415—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位： 山东省农业科学院奶牛研究中心、中国农业大学、山东奥克斯畜牧种业有限公司、 蒙天乳业有限公司、山东省畜牧总站。 本文件主要起草人：黄金明、戴蕴平、魏晓超、丁芳荣、王秀革、鞠志花、姜强、胡智胜、张亚冉、 高亚平、刘文浩、王金鹏、杨春红、李彦芹、宋明智、高运东、侯明海。 I DB 37/T 4415—2021 β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鉴定及牛奶中 β-乳球蛋白的检测技术 1 范围 本文件确立了β-乳球蛋白（BLG）基因敲除奶牛的定性聚合酶链式反应（PCR）鉴定方法，以及牛 奶中β-乳球蛋白（BLG）的定性免疫印迹（Western-Blot）和定量酶联免疫吸附（ELISA）检测方法。 本文件适用于β-乳球蛋白（BLG）基因敲除奶牛以及牛奶中β-乳球蛋白的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 GB/T 27642—2011 牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法 NY/T 1663—2008 乳与乳制品中β-乳球蛋白的测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 B NY/T 1672—2008 绵羊多胎主效基因Fec 分子检测技术规程 NY/T 2695—2015 牛遗传缺陷基因检测技术规程 SN/T 2497.16—2010 进出口危险化学品安全试验方法 第16部分：Western-Blot实验 农业部2031号公告-14-2013 转基因动物及其产品成分检测 普通牛 (Bos taurus) 内标准基因 定性PCR方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 牛β-乳球蛋白基因 Bos taurus β-lactoglobulin BLG BLG基因（NCBI Reference sequence: NC_037338.1），简称PAEP，来源于普通牛（Bos taurus）， 编码β-乳球蛋白的基因。 注： 基因全长4 900 bp，由7个外显子和6个内含子组成，编码252个氨基酸。 3.2 β-乳球蛋白基因敲除奶牛 β-lactoglobulin knockout cow 利用基因编辑技术敲除β-乳球蛋白基因的奶牛。 4 聚合酶链式反应（PCR）法-基因定性检测 4.1 原理 通过设计特异引物，扩增出包含牛BLG基因全长的DNA片段，对扩增产物进行测序分析。依据BLG基 因编码序列是否发生突变，并提前引入终止密码子，造成蛋白质编码异常，判断是否敲除BLG基因。 1 DB 37/T 4415—2021 4.2 试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 4.2.1 水：GB/T 6682，三级。 4.2.2 50×TAE 缓冲液： 称取 Tris-base 242.2 g，加入冰乙酸 57.1 mL，0.5 mol/L EDTA (pH8.0)100 mL， 用水定容至 1 000 mL。使用时，用水稀释为 1×TAE。 4.2.3 1 %琼脂糖凝胶：1 g 琼脂糖充分溶解于 1×TAE，定容至 100 mL。 4.2.4 BLG 基因引物： ——上游引物：5′-GCCTCTCGCATCTGACACTT-3′； ——下游引物：5′-AGTTTCAAAGAGCCGTAGATGTGTG-3′； ——预测野生型扩增片段大小为 6 728 bp。 4.2.5 内标准基因引物：参照农业部 2031 号公告-14-2013。 4.2.6 引物溶液：引物用水稀释到 10 μmol/L。 4.3 仪器设备 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.3.4 4.3.5 4.3.6 4.3.7 PCR 扩增仪：温度范围 4 ℃～99 ℃，温度梯度范围 20 ℃，模块单元 96×0.2 mL。 离心机：最高转速 12 000 r/min，最大容量 24×2 mL。 电子天平：量程 0.001 g～100 g，感量 0.001 g。 凝胶成像分析系统。 稳压稳流电泳仪：输出电压 0 V～600 V，输出电流 0 mA～100 mA。 高压灭菌锅：使用温度范围 45 ℃～135 ℃，最高使用压力 0.255 Mpa。 微波炉。 4.4 样品 4.4.1 4.4.2 4.4.3 4.4.4 采集静脉血样 3 mL～5 mL，医用抗凝管或 ACD 抗凝，-20 ℃以下保存。 采集组织（耳组织等）0.1 g～0.3 g，浸入 75%的酒精，-20 ℃以下保存。 采集带毛囊的牛毛 20～30 根，浸入 75 %的酒精或置于毛囊卡，-20 ℃以下保存。 采集 0.2 mL～0.5 mL 鲜精或 1～2 支细管冷冻精液，备用。 4.5 试验步骤 4.5.1 DNA 提取 基因组DNA提取按照GB/T 27642—2011附录B规定执行。 4.5.2 DNA 浓度和纯度检测 DNA浓度和纯度检测按照NY/T 1672—2008中7.3的规定执行。 4.5.3 PCR 扩增 4.5.3.1 样品 PCR 扩增 4.5.3.1.1 内标准基因 PCR 扩增 反应体系及反应程序按照农业部2031号公告-14-2013。 4.5.3.1.2 基因特异性序列 PCR 扩增 2 DB 37/T 4415—2021 4.5.3.1.2.1 PCR 扩增体系。Taq DNA 聚合酶 0.5 μL；2× PCR buffer 25 μL；dNTP Mixture (2.5 mM) 8 μL；上下游引物 (10 μM) 各 1.0 μL；模板 DNA 200 ng～1 μg；加双蒸水至总体积 50 μL。 4.5.3.1.2.2 PCR 扩增程序。94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s， 52 ℃ 30 s， 72 ℃ 6 min，35 个循环；72 ℃ 10 min， 4 ℃保存。 4.5.3.2 对照 PCR 扩增 以野生型奶牛基因组DNA（序列信息见附录A）作为阴性对照；以含有16 bp缺失的BLG基因敲除奶牛 基因组DNA（序列信息见附录B）作为阳性对照；以水作为空白对照。 除DNA模板外，对照PCR扩增条件与4.5.3.1.2相同。 4.5.4 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测 按照NY/T 2695—2015中6.4.2的规定执行。 4.5.5 测序分析 将检测合格的PCR产物进行全长测序分析。 4.6 结果判定与表述 4.6.1 对照检测结果分析 在内标基因、阳性对照和阴性对照PCR扩增中，内标基因和BLG基因特异性序列均扩增出与预期大小 一致的产物，空白对照无预期扩增片段，则表明PCR反应体系正常；否则，需重新扩增。 4.6.2 样品检测结果判定和表述 PCR扩增的β-乳球蛋白基因片段参考序列（野生型）见附录A。对测序结果和参考序列进行比对， 判定样品是否发生基因敲除。 4.6.2.1 如果样品序列与参考序列一致，未造成蛋白质编码异常，表述为“BLG 基因未敲除奶牛”。 4.6.2.2 如果样品序列与参考序列比对，出现突变，且提前引入了终止密码子，造成蛋白质编码异常， 表述为“BLG 基因敲除奶牛”。 5 免疫印迹（Western-Blot）法-蛋白定性检测 5.1 原理 对预处理的牛奶样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，使用牛β-乳球蛋白特异性第一抗体和辣根过氧 化物酶标记的第二抗体进行检测，根据条带位置和着色深度判定样品中是否含有β-乳球蛋白。 5.2 试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 5.2.1 水：GB/T 6682，三级。 5.2.2 牛β-乳球蛋白标准品储液（10 mg/mL）：称取 0.1 g 牛β-乳球蛋白，溶解于 10 mL 双蒸水中， 分装，-20 ℃以下保存。 5.2.3 10 % SDS：将 10 g 的 SDS 粉末溶于 80 mL 蒸馏水中，充分溶解后，定容至 100 mL。 5.2.4 30 %丙烯酰胺：将 29 g 丙烯酰胺和 1 g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为 60 mL 的蒸馏水中， 充分溶解后，定容至 100 mL。 3 DB 37/T 4415—2021 5.2.5 1.5 M Tris-HCl(pH8.8)：将 181.65 g Tris 溶于 800 mL 蒸馏水中，加浓盐酸调 pH 至 8.8，定 容至 1 000 mL。 5.2.6 1 M Tris-HCl(pH=6.8)：将 121.1 g Tris 溶于 800 mL 蒸馏水中，加浓盐酸调 pH 至 6.8，定容 至 1 000 mL。 5.2.7 10 %过硫酸铵：将 10 g 过硫酸铵粉末溶于 80 mL 蒸馏水中，充分溶解后，定容至 100 mL。 5.2.8 15 % SDS-PAGE 分离胶（5 mL）：1.1 mL 蒸馏水，2.5 mL 30 %丙烯酰胺溶液，1.3 mL 1.5 M Tris-HCl(pH8.8)，0.05 mL 10 %SDS，0.05 mL 10 %过硫酸铵，0.002 mL TEMED。 5.2.9 5 % SDS-PAGE 浓缩胶（2 mL）：1.4 mL 蒸馏水，0.33 mL 30 %丙烯酰胺溶液，0.25 mL 1.0 M Tris-HCl(pH6.8)，0.02 mL 10 %SDS，0.02 mL 10 %过硫酸铵，0.002 mL TEMED。 5.2.10 10×转膜液（500 mL）：15.1 g Tris，75 g 甘氨酸溶于蒸馏水中至终体积为 500 mL。 5.2.11 10×TBS（1 L）：88 g 氯化钠，12.1 g Tris 溶于蒸