(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210137535.8 (22)申请日 2022.02.15 (71)申请人 广州奥测生物技 术有限公司 地址 510000 广东省广州市黄埔区黄埔东 路1407号209-13房 (72)发明人 邓红辉　卢晨丽　黎剑平　邢阿宝　 (74)专利代理 机构 北京市隆安 律师事务所 11323 专利代理师 权鲜枝 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) (54)发明名称 一种检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变 的引物组合以及方法 (57)摘要 本发明提供了一种检测人类胚胎α ‑地中海 贫血基因突变的引物组合以及方法。 由特异性扩 增中国人群α ‑地贫基因的SEA、 4.2kb、 3.7kb这 三种最常见缺失型突变(20对)以及WS、 QS、 CS三 个最常见点突变的引物(1对)， 以及特异扩增 Alpha缺失区域连锁SNP位点区域(包括α ‑珠蛋 白基因HBA1、 HBA2基因)以及HBA基因下游1 ‑2Mb 范围内紧密连锁的单核苷酸多态性(SNP)位点的 引物组成(65对)， 合计86对引物。 本发明还提供 了使用86对引物组合， 并基于高通量测序平台进 行检测的检测方法。 本发明无需对目标区域进行 全部扩增， 同时对应区域的SNP分析可以直接判 定胚胎的缺失类型。 权利要求书7页 说明书21页 附图3页 CN 115323048 A 2022.11.11 CN 115323048 A 1.一种检测人类胚胎α ‑地中海贫血基因突变的引物组合， 其特征在于， 所述引物组合 包括序列为SEA  ID NO： 1～86的多重PCR引物。 2.如权利要求1所述检测人类胚胎α ‑地中海贫血基因突变的引物组合， 其特征在于包 括由特异性扩增人群α ‑地贫基因的SEA、 4.2kb、 3.7kb三种缺失型突变的引物20对， 和WS、 QS、 CS三种点突变的引物1对， 以及包括α ‑珠蛋白基因HBA1、 HBA2特异扩增Alpha缺失区域的 连锁SNP位 点区域和HBA基因下游1 ‑2Mb范围内 紧密连锁的SNP位 点的引物6 5对。 3.一种检测人类胚胎α ‑地中海贫血基因突变的方法， 其特征在于， 使用了如权利要求1 或2任意一项所述检测人类 胚胎α‑地中海贫血基因突变的引物组合， 包括如下步骤： 步骤一： 提取待测夫妻双方外周血DNA以及胚胎细胞进行全基因组扩增： 对外周血进行 DNA提取， 富集外周血基因组DNA， 并且将来自体外培养的第3 ‑6天卵裂期或囊胚期滋养层细 胞经过单细胞全基因 组扩增对细胞中的基因 组DNA进行富 集， 对得到的DNA进行浓度测定； 步骤二： 目标片段扩增： 将步骤一富集后的DNA与多重PCR扩增试剂和上述引物组合混 合， 经多重PCR反应， 得到扩增后的目的基因DNA片段； 步骤三： 扩增产物纯化： 将多重PCR反应后的DNA片段进行磁珠纯化， 去除多余的小片段 接头及多余的引物， 得到纯化的多重产物； 步骤四： 末端补平： 在步骤三得到的DNA片段中加入可与黏性末端结合的引物， 与末端 补平试剂混合并经 过孵育， 得到平末端的DNA样本； 步骤五： 接头连接： 将步骤四得到的平末端DNA样本与P1接头、 adapter接头及接头连接 反应试剂混合进行 连接反应， 得到连接 接头的DNA片段； 步骤六： 磁珠纯化： 将步骤五连接接头的DNA片段进行磁珠纯化， 去除多余的小片段接 头及多余的引物， 得到纯化的连接 接头DNA片段； 步骤七： 文库扩增与检测： 将步骤六纯化的连接接头DNA片段加入文库扩增引物及文库 扩增反应试剂进行PCR扩增， 并采用磁珠进行纯化， 得到目标片段的DNA文库， 并对得到的 DNA文库进行浓度测定 。 步骤八： 高通 量测序： 采用高通 量测序平台对步骤 七得到的DNA文库进行高通 量测序； 步骤九： 生物信息学分析： 对胚胎活检细胞的全基因组扩增产物及家系全血DNA样本进 行多重捕获测序后进 行生物信息学SNP分析， 获得夫妇双方及致病基因连锁单倍型信息， 再 根据胚胎样本的测序数据判断是否 遗传了父母亲的致病单体型。 4.如权利要求3所述检测人类胚胎α ‑地中海贫血基因突变的方法， 其特征在于， 所述步 骤二中的多重PCR反应条件为： 变性： 95℃变性10mi n， 1个循环 预扩增： 预变性： 94℃变性3 0s， ； 退火： 58℃退火2mi n、 60℃退火3mi n、 62℃退火1mi n； 延伸： 72℃延伸1mi n； 退火+延伸5个 循环； 富集扩增： 变性： 94℃  20s 退火： 66℃退火3mi n， 25个循环； 4℃终止。 5.如权利要求3所述检测人类胚胎α ‑地中海贫血基因突变的方法， 其特征在于， 所述步权　利　要　求　书 1/7 页 2 CN 115323048 A 2骤五中的P1接 头序列为： CCACTACGC CTCCGCTTTCCTCTCTATG GGCAGTCGGTGAT ATCACCGACTGCCCATAGAGAG GAAAGCGGAGGCGTAGTG G‑s‑T‑s‑T 所述adapter接头是 由如下正反两个序列 组成的96个Barcode  x， Barcode  x代表的具 体序列如下： A1‑index 1 CCATCTCATC CCT‑s‑G‑s‑CGTGTCTC CGACTCAGCTA AGGTAACGAT A1‑1 ATCGTTACCTTAGCTGAGTCG GAGACACGC A1‑index 2 CCATCTCATC CCT‑s‑G‑s‑CGTGTCTC CGACTCAGTA AGGAGAACGAT A2‑1 ATCGTTCTCCTTACTGAGTCG GAGACACGC A1‑index 3 CCATCTCATC CCT‑s‑G‑s‑CGTGTCTC CGACTCAGA AGAGGATTCGAT A3‑1 ATCGAATCCTCTTCTGAGTCG GAGACACGC A1‑index 4 CCATCTCATC CCT‑s‑G‑s‑CGTGTCTC CGACTCAGTAC CAAGATCGAT A4‑1 ATCGATCT TGGTACTGAGTCG GAGACACGC A1‑index 5 CCATCTCATC CCT‑s‑G‑s‑CGTGTCTC CGACTCAGCAGA AGGAACGAT A5‑1 ATCGTTCCTTCTGCTGAGTCG GAGACACGC A1‑index 6 CCATCTCATC CCT‑s‑G‑s‑CGTGTCTC CGACTCAGCTGCA AGTTCGAT A6‑1 ATCGAACTTGCAGCTGAGTCG GAGACACGC A1‑index 7 CCATCTCATC CCT‑s‑G‑s‑CGTGTCTC CGACTCAGT TCGTGATTCGAT A7‑1 ATCGAATCACGAACTGAGTCG GAGACACGC A1‑index 8 CCATCTCATC CCT‑s‑G‑s‑CGTGTCTC CGACTCAGT TCCGATAACGAT A8‑1 ATCGTTATCGGAACTGAGTCG GAGACACGC A1‑index 9 CCATCTCATC CCT‑s‑G‑s‑CGTGTCTC CGACTCAGTGAGCG GAACGAT A9‑1 ATCGTTCCGCTCACTGAGTCG GAGACACGC A1‑index 10 CCATCTCATC CCT‑s‑G‑s‑CGTGTCTC CGACTCAGCTGAC CGAACGAT A10‑1 ATCGTTCGGTCAGCTGAGTCG GAGACACGC A1‑index 11 CCATCTCATC CCT‑s‑G‑s‑CGTGTCTC CGACTCAGTC CTCGAATCGAT A11‑1 ATCGATTCGAGGACTGAGTCG GAGACACGC A1‑index 12 CCATCTCATC CCT‑s‑G‑s‑CGTGTCTC CGACTCAGTAG GTGGTTCGAT A12‑1 ATCGAACCACCTACTGAGTCG GAGACACGC A1‑index 13 CCATCTCATC CCT‑s‑G‑s‑CGTGTCTC CGACTCAGTCTA ACGGACGAT A13‑1 ATCGTCCGTTAGACTGAGTCG GAGACACGC A1‑index 14 CCATCTCATC CCT‑s‑G‑s‑CGTGTCTC CGACTCAGT TGGAGTGTCGAT A14‑1 ATCGACACTC CAACTGAGTCG GAGACACGC A1‑index 15 CCATCTCATC CCT‑s‑G‑s‑CGTGTCTC CGACTCAGTCTAGAG GTCGAT A15‑1 ATCGACCTCTAGACTGAGTCG GAGACACGC A1‑index 16 CCATCTCATC CCT‑s‑G‑s‑CGTGTCTC CGACTCAGTCTG GATGACGAT A16‑1 ATCGTCATC CAGACTGAGTCG GAGACACGC A1‑index 17 CCA