(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210159716.0 (22)申请日 2022.02.22 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114517229 A (43)申请公布日 2022.05.20 (73)专利权人 南京市妇幼保健院 地址 210011 江苏省南京市 建邺区莫愁路 天妃巷123号 (72)发明人 文娟　马锦琪　章乐　李鹰　李欣　 袁迎第　 (74)专利代理 机构 南京思拓知识产权代理事务 所(普通合伙) 32288 专利代理师 吕鹏涛 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01)C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) 审查员 蒋红云 (54)发明名称 血清外泌体RNA在制备妊娠糖尿病性巨大儿 筛查或早期诊断试剂中的应用 (57)摘要 本发明公开了血清外泌体RNA在制备妊娠糖 尿病性巨大儿筛查或早期 诊断试剂中的应用。 检 测血清外泌体来源的mRNA  GDF3和lncRNA   AC006064.4的试剂在制备妊娠糖尿病性巨大儿 高危孕妇筛查或早期诊断试剂中的应用。 本发明 利用血清外泌体来源的mRNA  GDF3和lncRNA   AC006064.4表达水平， 结合孕妇年龄、 空腹血糖 和2h血糖， 对妊娠糖尿病性巨大儿早期诊断的特 异性可达1.00， 灵 敏度达到0.55。 因此， 上述两个 指标的试剂能用于妊娠糖尿病性巨大儿辅助早 期诊断， 为临床医生准确预测巨大儿发生风险， 及时采取更具个体化的防治 方案提供支持， 从而 最大限度的减少不良妊娠结局。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图2页 CN 114517229 B 2022.12.02 CN 114517229 B 1.检测血清外泌体来源的mRNA  GDF3和lncRNA  AC006064.4 的试剂在制备妊娠糖尿病 性巨大儿高危孕妇筛查或早期诊断试剂中的应用。 2.根据权利 要求1所述的应用， 其特征在于所述的检测血清外泌体来源的mRNA  GDF3和 lncRNA AC006064.4的试剂为定量检测血清外泌体来源的mRNA  GDF3和lncRNA  AC006064.4 的实时荧 光定量PCR检测试剂。 3.根据权利 要求2所述的应用， 其特征在于所述的检测血清外泌体来源的mRNA  GDF3和 lncRNA AC006064.4的试剂包含检测mRNA  GDF3和lncRNA  AC006064.4的实时荧光定量PCR 特异性引物。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于所述的检测 mRNA GDF3的实时荧光定量PCR 特异性引物如SEQ  ID NO.3和SEQ  ID NO.4所示； 所述的检测lncRNA  AC006064.4的实时荧 光定量PCR特异性引物如SEQ  ID NO.5和SEQ  ID NO.6所示。 5.一种妊娠糖尿病性巨大儿高危孕妇筛查或早期诊断试剂盒， 其特征在于包含检测血 清外泌体来源的mRNA  GDF3和lncRNA AC006064.4的试剂。 6.根据权利要求5所述的妊娠糖尿病性巨大儿高危孕妇筛查或早期诊断试剂盒， 其特 征在于所述的试剂盒包含定量检测血清外泌体来源的mRNA  GDF3和lncRNA  AC006064.4的 实时荧光定量PCR检测试剂。 7.根据权利要求6所述的妊娠糖尿病性巨大儿高危孕妇筛查或早期诊断试剂盒， 其特 征在于所述的试剂盒包含检测mRNA  GDF3和lncRNA  AC006064.4的实时荧光定量PCR特异性 引物。 8.根据权利要求7所述的妊娠糖尿病性巨大儿高危孕妇筛查或早期诊断试剂盒， 其特 征在于所述的试剂盒包含SEQ  ID NO.3和SEQ  ID NO.4所示的检测mRNA  GDF3的实时荧光定 量PCR特异性引物和SEQ  ID NO.5和SEQ  ID NO.6所示的检测lncRNA  AC006064.4的实时荧 光定量PCR特异性引物。 9.根据权利要求8所述的妊娠糖尿病性巨大儿高危孕妇筛查或早期诊断试剂盒， 其特 征在于所述的试剂盒包 含： （1） 以从血清外泌体中分离纯化的总RNA为模板， 将mRNA  GDF3和LncRNA  AC015961.2逆 转录为cDNA的试剂， 包括逆转录缓冲液、 三磷酸碱基脱 氧核苷酸、 RNA酶抑制剂、 MMLV逆转录 酶以及mRNA  GDF3和LncRNA AC015961.2所用随机引物； （2） 实时定量PCR所用试剂， 包括检测mRNA  GDF3的实时荧光定量PCR特异性引物、 检测 lncRNA AC006064.4的实时荧光定量PCR特异性引物、 U6snRNA内参特异性PCR引物、 实时荧 光定量 SYBR染料、 无酶水。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114517229 B 2血清外泌体RNA在制备妊娠糖尿病性巨大儿筛查或早期诊断 试剂中的应用 技术领域 [0001]本发明属于产科分子生物学领域， 具体涉及血清外泌体RNA在制备妊娠糖尿病性 巨大儿筛查或早期诊断试剂中的应用。 背景技术 [0002]巨大儿是指出生体重达到或超过4000克的婴儿， 是妊娠期糖尿病(GDM， gestational  diabetes  mellitus)最常见的不良妊娠结局。 据国际糖尿病联盟2019年最新 统计， 全球超过15％的活产儿在怀孕期间受到高血糖影响， 其中83.6％为GDM。 近年来， 随着 我国生活水平的提高及 “全面二孩 ”政策的实施， 体重超标或 高龄的孕妇越来越多， GD M发病 率逐年递增， 使得GDM性巨大 儿发病率也急剧升高， 严重威胁母婴健康。 GD M性巨大儿多属代 谢不对称型， 表现为全身脂肪重量明显增多， 而其他组织/脏器体积增大并不明显， 不仅影 响婴儿的生长发育， 且大大增加儿童青少年期及成年后肥胖或糖尿病的发生风险。 著名的 “健康与疾病发育起源(DOHaD) ”学说认为， 生命最初1000天的营养和养育环 境(如宫内高糖 环境等)， 对个体一生的健康影响至 关重要。 因此， 早期诊断、 早期干预、 及时合理治疗， 无论 对临床控制GD M巨大儿发生， 还是对减少母婴并发症、 延缓GD M子代发展为肥胖或糖尿病， 均 具有十分重要的意 义。 [0003]外泌体(Exosomes)作为稳定的细胞间信息通讯载体， 是由正常或病理细胞内多囊 泡体通过内吞作用形成的小囊泡， 与胞膜融合后分泌到细胞外所形成的一群双层膜结构的 囊性小泡， 直径在30～150nm之间。 分泌细胞在 受到某种刺激后， 应激释放的外泌体可通过 近分泌、 膜融合、 配体 ‑受体结合、 吞噬等方式进入受体细胞， 释放所包裹的众多异常表达的 生物活性物质， 如mRNA、 非编码RNA(包括lncRNA)、 蛋 白质等， 影响受体细胞的生物学功能， 进而参与各种生理病理过程， 即外泌体在分泌细胞和受体细胞之间发挥信息传递作用。 研 究表明， 早在妊娠第6周即可在孕母血浆中检测到胎盘滋养细胞来源的特异 性外泌体， 且随 着妊娠的进展， 胎盘源性外泌体浓度不 断增加； 对于孕早、 中、 晚期的GDM孕妇， 胎盘源性外 泌体浓度均明显高于同期正常孕妇， 提示胎盘向母体循环释放外泌体的过程可受血糖调 节。 [0004]外泌体因受到双层膜结构的保护， 其包裹的lnc RNA等内容物 可免于核糖核酸酶的 降解， 从而能在外周血、 脐血、 羊水、 乳汁、 唾液等多种体液中广泛检测， 可作为疾病发生发 展良好的生物标志物。 然而， 目前尚未见外泌体RNA作为巨大儿生物标志物的相关研究报 道。 利用外泌体来源的mRNA  GDF3和lncRNA  AC006064.4来辅助诊断GDM巨大儿不仅能更好 的对GDM巨大儿进行早期诊断、 早期 干预， 而且使 得检验结果更加灵敏， 特异。 以上显示出血 清外泌体来源的mRNA  GDF3和lncRNA  AC006064.4在GDM巨大儿早期 诊断和筛查中的巨大潜 力。说　明　书 1/7 页 3 CN 114517229 B 3