(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221017815 0.6 (22)申请日 2022.02.24 (71)申请人 中国科学院苏州生物医学工程 技术 研究所 地址 215163 江苏省苏州市高新区科技城 科灵路88号 (72)发明人 孙义祥　陈弘毅　宋一之　林恺铖　 胡慧杰　王敬开　郄兴旺　孙博书　 (74)专利代理 机构 北京远大卓悦知识产权代理 有限公司 1 1369 专利代理师 贺杰 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/445(2006.01) (54)发明名称 金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄 球菌核酸快速 检测方法及试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种金黄色葡萄球菌和耐甲 氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法及试 剂盒， 该方法包括以下步骤： 1)待测样品核酸提 取； 2)核酸恒温扩增： 对金黄色葡萄球菌特有的 nuc1基因或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特有的 mecA基因的核酸进行环介导核酸恒温扩增； 3)扩 增产物检测： 利用CRISPR ‑Cas12a体系检测扩增 后的nuc1基因或mecA基因。 本发明首次采用 CRISPR‑Cas12a荧光探针法检测金黄色葡萄球菌 和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸， 具有灵敏度 高、 特异性强、 耗时短、 高通量、 不依赖大型实验 设备等优势； 能方便用于基层实验和临床一线对 金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 核酸的基层快速 检测。 权利要求书2页 说明书9页 序列表1页 附图2页 CN 114480690 A 2022.05.13 CN 114480690 A 1.一种金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法， 其特征在 于， 包括以下步骤： 1)待测样品核酸 提取； 2)核酸扩增： 利用核酸扩增体系对金黄色葡萄球菌特有的nuc1基因或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 特有的mecA基因的核酸扩增； 3)扩增产物检测： 利用CRISPR ‑Cas12a体系检测扩增后的nuc1基因或mecA基因， CRISPR ‑Cas12a体系中， nuc1基因用nuc1 ‑crRNA进行检测， mecA基因用mecA ‑crRNA进行检测； nuc1‑crRNA的序列为： 5’ ‑UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUA AUGGUAAAGAUAAAGUACA‑3’； mecA‑crRNA的序列为： 5’ ‑UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUC CAAUAACUGCAUCAUCU UU‑3’。 2.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测 方法， 其特征在于， 所述步骤2)中， 核酸扩增采用聚合酶链式反应、 重组酶聚合酶扩增或环 介导核酸恒温扩增方法。 3.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测 方法， 其特征在于， 所述步骤2)中， 核酸扩增采用环介导核酸恒温扩增方法， 核酸扩增 体系 包括用于nuc1基因的扩增引物组和用于mecA基因的扩增引物组； 用于nuc1基因的扩增引物组包括： nuc1‑F3： 5’ ‑TCGCTTGCTATGAT TGTGG‑3’； nuc1‑B3： 5’ ‑ACATACGC CAATGTTCTACC‑3’； nuc1‑FIP： 5’ ‑GTACAGTTTCATGATTCGTCCCGCCATCATTATTGTAGGTGT‑3’； nuc1‑BIP： 5’ ‑TGTTCAAAGAGTTGTGGATGGTGTACAG GCGTATTCGGTT‑3’； nuc1‑FLP： 5’ ‑TTGAAAGGACCCGTATGAT TCA‑3’； nuc1‑BLP： 5’ ‑GATACGCCAGAAACGGTGA‑3’。 4.根据权利要求3所述的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测 方法， 其特 征在于， 用于mecA基因的扩增引物组包括： mecA‑F3： 5’ ‑GGTACAAGATGATAC CTTCGTT‑3’； mecA‑B3： 5’ ‑ATAGCAGTAC CTGAGCCAT‑3’； mecA‑FIP： 5’ ‑TCTTCAGAGTTAATGGGACCAAACAGAAAGTCGTAACTATCCTC‑3’； mecA‑BIP： 5’ ‑AAGCTCCAACATGAAGATGGCTTGTATGTGCGAT TGTATTGC‑3’； mecA‑FLP： 5’ ‑ACCTAATAGATGTGA AGTCGCT‑3’； mecA‑BLP： 5’ ‑CGTGTCACA ATCGTTGACG‑3’。 5.根据权利要求4所述的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114480690 A 2方法， 其特征在于， CRISPR ‑Cas12a体系还包括LaC as12a和ssDNA荧光探针， ssDNA荧光探针 的序列为： 5 ’ ‑6FAM‑TTTATTT‑3’ ‑BHQ1。 6.根据权利要求5所述的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测 方法， 其特征在于， 所述步骤1)中采用酶解法、 反复冻融法、 煮沸法、 磁珠法或吸附柱法进 行 核酸提取。 7.根据权利要求6所述的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测 方法， 其特征在于， 所述步骤1)中酶解法进行核酸提取， 具体方法为： 取待测样品， 离心后去 上清， 加入TE溶液， 混匀， 离心去上清， 加入溶菌酶和Triton  X‑100， 混匀， 37℃， 反应， 得到 待测样品的核酸 提取液。 8.根据权利要求7所述的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测 方法， 其特征在于， 所述步骤2)包括： 取步骤1)得到的核酸提取液加入到恒温扩增体系中， 于55‑70℃下恒温反应， 扩增nuc1基因或mecA基因。 9.根据权利要求8所述的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测 方法， 其特征在于， 恒温扩增体系中还包括Primer  mix、 Isothermo  Buffer、 Mg2+、 dNTP、 H2O 和聚合酶。 10.根据权利要求9所述的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检 测方法， 其特征在于， 所述步骤3)包括： 取经步骤2)扩增后的产物加 入到CRISPR ‑Cas12a体 系中， 混合均匀后于26 ‑42℃反应， 检测反应的荧光， 其中激发波长为475 ‑495nm， 发射波长 为510‑530nm。 11.根据权利要求9所述的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检 测方法， 其特征在于， 其中， CRISPR ‑Cas12a体系包 括LaCas12a、 ssDNA荧光探针、 nuc1 ‑crRNA 或mecA‑crRNA、 TOLO  Buffer和H2O。 12.一种金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测试剂盒， 其特征 在于， 包括如权利要求1 ‑11中任意一项所述的核酸扩增体系和CRIS PR‑Cas12a体系。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114480690 A 3