(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210224598.7 (22)申请日 2022.03.07 (71)申请人 广西大学 地址 530004 广西壮 族自治区南宁市西乡 塘区大学东路10 0号 (72)发明人 范东升　张得平　舒芳玲　卢燕回　 袁高庆　林纬　 (74)专利代理 机构 北京众达德权知识产权代理 有限公司 1 1570 专利代理师 张晓冬 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/77(2006.01) C12R 1/645(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种同时检测烟草5种病原菌的引物组、 试 剂盒及其应用 (57)摘要 本发明属于烟草病害检测技术领域， 具体涉 及一种同时检测烟草5种病原菌的引物组、 试剂 盒及其应用。 一种同时检测烟草5种病原菌的引 物组， 包括5对特异性引物： 引物对Sf1和Sr1、 引 物对Rf1和Rr1、 引物对Ff1和 Fr1、 引物对TBf1和 TBr1以及引物对Pf1和Pr1， 其分别对应具有如 SEQ ID No.1至SEQ  ID No.10所示的序列。 本发 明的引物组和试剂盒能够同时快速检测烟草黑 胫病菌、 青枯病菌、 立枯病菌、 根腐病菌和根黑腐 病菌以及田间带菌烟草病株和土壤， 对混合DNA 检测的灵敏度达到了100pg/μL， 可以为烟草土 传病害以及同种病原菌引起的其他作物病害的 快速诊断、 早期监测预警以及防控提供有力依 据， 具有较高的应用前 景。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图3页 CN 114438257 A 2022.05.06 CN 114438257 A 1.一种同时检测烟草5种病原菌的引物组， 其特征在于， 包括5对特异性引物： 引物对 Sf1和Sr1、 引物对Rf1和Rr1、 引物对Ff1和Fr1、 引物对TBf1和TBr1以及引物对Pf1和Pr1， 其 分别对应具有如SEQ  ID No.1至SEQ ID No.10所示的序列。 2.一种同时检测烟草5种病原菌的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括以下多重PCR 反应体系： 2 ×PCR Mix 12.5 μL、 待测病原菌模板D NA各1 μL、 5对特异性引物混合物， 加ddH2O 补足至25μL； 其中， 所述5对特异性引物分别为引物对Sf1和Sr1、 引物对Rf1和 Rr1、 引物对 Ff1和Fr1、 引物对TBf1和TBr1以及引物对Pf1和Pr1， 其分别对应具有如SEQ  ID No.1至SEQ   ID No.10所示的序列。 3.根据权利要求2所述的同时检测烟草5种病原菌的试剂 盒， 其特征在于， 所述5对特异 性引物混合物具体为： 引物对Sf1和Sr1、 引物对Ff1和Fr1以及引物对Pf1和Pr1各0.3 μL、 引 物对Rf1和Rr1  1.8 μL以及引物对TBf1和TBr1 1 μL。 4.根据权利要求2所述的同时检测烟草5种病原菌试剂 盒， 其特征在于， 所述多重PCR反 应体系的多重PCR反应条件为： 94℃预变性5min； 94℃变性30s， 58℃退火30s， 72℃延伸30s， 循环30次； 72℃延伸10mi n。 5.根据权利要求1所述的同时检测烟草5种病原菌引物 组或权利要求2 ‑4任一项所述的 同时检测烟草5种病原菌的试剂盒在检测烟草黑胫病、 青枯病、 立枯病、 根腐病和根黑腐病 上应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114438257 A 2一种同时检测烟草5种病原菌的引物组、 试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明属于烟草病害检测技术领域， 具体涉及一种同时检测烟草黑胫病、 青枯病、 立枯病、 根腐病和根 黑腐病的引物组、 试剂盒及其应用。 背景技术 [0002]烟草是我国重要的经济作物， 但田间易受多种病害的威胁， 其中根茎部土传病害 危害严重， 导致烟草的产量和品质下降， 严重制约我国烟草产业的发展。 烟草上分布较广的 重要土传病害包括烟草疫霉(Phytophthora  parasitica)引起的黑胫病、 假茄科雷尔氏菌 (Ralstonia pseudosolanacearum)引起的青枯病、 立枯丝核菌(Rhizoctonia  solani)引起 的立枯病、 尖孢镰刀菌(Fusarium  oxysporum)引起的根腐病以及基生根串珠霉 (Thielaviopsis  basicola)引起的根黑腐病等， 这五种病害发病早期隐蔽性强， 发病症状 比较类似， 并且待发病明显时多已难以救治， 田间很难从症状上准确区分， 容易导致误诊而 无法有效控制病害蔓延。 另外， 土传病害易发生复合侵染， 增加病害诊断和防治的难度。 因 此， 建立一种能够在早期对多种烟草土传病原菌进 行快速、 准确、 高效的检测方法有助于控 制烟草土传病害带来的严重损失。 常规检测方法主要是对病株进行分离鉴定， 其分离难度 大， 灵敏度低， 耗时长， 难以满足生产上的需求。 血清学检测易出现假阳性反应且一次只能 检测一种病原。 近年来， 随着分子生物学的发展， 已有很多PCR相关技术运用在植物病害的 快速检测方面。 如利用环介导等温技术扩增实现了对假茄科雷尔氏菌的快速分子鉴定。 利 用巢式PCR实现了对烟草疫霉的快速鉴定。 利用UP ‑PCR分子技术实现了对立枯丝核菌的快 速鉴定。 利用比较基因组学的方法， 建立了尖孢镰刀菌的多重P CR检测体系。 用多重PCR技术 实现了对烟草疫霉和烟草根腐病的快速检测。 但田间烟草土传病原菌种类较多， 建立同时 检测更多病原菌种类的技 术将提高检测效率和应用价 值。 [0003]多重PCR技术是在同一反应体系中加入多对特异性引物， 同时扩增出多个核酸片 段的PCR反应， 其原理与常规PCR相同。 在病害研究中， 主要应用于多种病原物的同步检测 。 与常规PCR相比， 多重PCR具有成本低、 检测效率高等优点。 目前也有运用多重PCR检测烟草 病原菌的报道， 但 不同烟草种植区域病害种类有 所不同， 病原菌 分布不一致， 需要根据当地 病害发生情况设计相应病原菌组合的多重PCR体系。 [0004]在多重PC R分子检测技术中， 为每个目的病原菌设计出特异性引物， 保证各病原菌 引物之间没有交叉反应是成功的关键。 另外， 引物扩增片段的大小应存在一定差异， 便于区 分。 其次， 引物浓度对多重PCR扩增也很 重要， 必须保证所有的引物具有相似的扩增效率。 [0005]广西高温高湿的气候特点特别有利于多种烟草土传病害的发生， 以黑胫病和青枯 病为主， 另外还有立枯病、 根腐病、 根黑腐病等在局部区域分布。 本研究建立了一种同时检 测更多病原菌种类的多重P CR方法， 能够同时检测田间病株和土壤中烟草黑胫病菌、 青枯病 菌、 立枯病菌、 根腐病菌和根黑腐病菌， 对混合DNA检测的灵敏度达到了100pg/ μL， 进一步提 高了检测效率， 可以更好 地服务于当地烟草农业 生产。 [0006]公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解， 而不应说　明　书 1/7 页 3 CN 114438257 A 3