(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210220529.9 (22)申请日 2022.03.08 (71)申请人 河南中检食安 生物科技有限公司 地址 450000 河南省郑州市经济技 术开发 区航海东路与二十五大街交叉口西北 角联东U谷产业园25号楼4楼 (72)发明人 许世伟　王群智　许远　邵俊影　 吴镇宇　王欣　林圣博　 (74)专利代理 机构 成都顶峰专利事务所(普通 合伙) 51224 专利代理师 钱学宇 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/445(2006.01) (54)发明名称 闭管恒温变色检测金黄色葡萄球菌的LAMP 检测引物组、 试剂盒及检测方法 (57)摘要 本发明提供一种闭管恒温变色检测金黄色 葡萄球菌的LAMP检测引物组、 试剂盒及检测方 法， 属于生物技术领域。 该LA MP检测引物组， 检测 引物组针对金黄色葡萄球菌的isdD基因编码序 列设计， 检测引物组包括外引物F3、 外引物B3、 内 引物FIP、 内引 物BIP和环引 物LF。 LAMP检测试剂 盒包括这种检测引物组。 这种试剂盒及检测方 法， 以金黄色葡萄球菌isdD基因为检测靶标， 这 种isdD基因相比于nuc基因兼具特异性及保守 型， 所设计引物具有良好的特异性， 和其它种属 细菌的同源性非常低， 无交叉反应。 假阳性率低， 检测的灵敏度高， 检测限可达102cfu/mL。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图2页 CN 114540517 A 2022.05.27 CN 114540517 A 1.一种闭管恒温变色检测金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组， 其特征在于， 所述检测 引物组针对金黄色葡萄球菌的isdD基因编码序列设计， 所述检测引物组包括外引物F3、 外 引物B3、 内引物FIP、 内引物BIP和环引物LF； 所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示； 所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示； 所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示； 所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示； 所述环引物LF的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示。 2.一种闭管恒温变色检测金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂 盒含有如权利要求1所述的检测引物组。 3.权利要求1述的LAMP检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还包括以下一种或多种组 分： DNA聚合酶、 dNTPs、 显色剂、 甜菜碱、 pH调节剂、 d dH2O、 buffer。 4.根据权利 要求3所述的LAMP检测试剂盒， 其特征在于， 所述外引物F3和所述外引物B3 的浓度均为0.15～0.25 μM， 所述内引物FIP与所述内引物BIP的浓度均为1.5～1.7μM， 所述 环引物LF的浓度为0.4～0.8 μM 。 5.根据权利要求3所述的LAMP检测试剂盒， 其特征在于， 所述显色剂为酚红、 甲酚或中 性红。 6.根据权利要求3所述的LAMP检测试剂盒， 其特征在于， 所述pH调节剂为Tris ‑HCl或 NaOH。 7.根据权利要求3所述的LAMP检测试剂盒， 其特征在于， 所述buffer中含有95～105mM 的KCl、 95～10 5mM的(NH4)2SO4、 100mM的MgSO4、 1％‑2％triton‑100。 8.一种闭管恒温变色检测金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法， 其特征在于， 其利用如权 利要求2～7任一项所述的检测试剂盒进行检测， 包括： 将来自待测样品中的模板DNA与LAMP反应 体系混合， 进行LAMP扩增。 9.根据权利要求8所述的LAMP检测方法， 其特征在于， 所述LAMP扩增的温度为60～65 ℃， 时间为5 0～70min。 10.根据权利要求8所述的LAMP检测方法， 其特征在于， 所述LAMP反应体系为25μL， 包 括： 0.2～0.4μM/L 的外引物F3、 0.2～0.4μMμM/L 的外引物B3、 1.2～2.0μM/L 的内引物FIP、 1.2～2.0 μM/L的内引物BIP、 0.4 ‑0.8 μM/L的环引物LF、 8 ‑12U活性单位的BS T DNA聚合酶、 8 ‑ 16mM/L的显色剂、 0.8 ‑1.2mM/L的pH调节剂以及0.6～0.8M /L的甜菜碱 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114540517 A 2闭管恒温变色检测金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组、 试剂 盒及检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种闭管恒温变色检测金黄色葡萄球菌的 LAMP检测引物组、 试剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性， 是一种无芽孢， 鞭毛， 乳酸发酵， 兼性厌氧的球状 细菌， 为一种常见的食源性致病微生物， 常寄生于人和动物的皮肤、 鼻腔、 咽喉、 肠胃、 疮口 中， 环境中也无处不在， 往 往对人体造成侵害。 [0003]目前常用的金黄色葡萄球菌检测方法包括显色培养基培养法、 常规PCR法、 荧光定 量PCR等， 均可以有效地检测 。 但显色培养法存在耗时长、 人为因素大、 难以标准化等缺点， 检测一个样本往往需要1周， 还存在结果不一致性。 荧光定量PCR通量大， 检测时间短， 只需 要2‑4小时， 但需要经过变性、 退火、 延伸等步骤， 要依托精密昂贵的仪器及专业检测人员， 成本高， 不利于推广。 [0004]环介导恒温扩增技术是一种不需要精确控温过程的基因诊断技术， 借助6条特异 性引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶， 可在等温条件 下快速， 高特异 性和灵敏的扩增 靶序列， 检测全 过程只需要在60 ‑65℃条件下扩增40 ‑60min， 具有操作简单、 反应时间短、 特 异性高、 灵敏度高等特点， 广泛应用于病原菌检测领域。 [0005]目前对金黄色葡萄球菌进行检测的靶标基因主要集中在nuc耐热核酸酶基因、 脱 氢酶基因aroE等， 但现实研究过程中发现其 他菌种也具有nuc等基因， 存在假阳性隐患。 发明内容 [0006]本发明针对现有的检测方法对金黄色葡萄球菌检测容易出现假阳性的问题， 提供 一种闭管恒温变色检测金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组、 试剂盒及检测方法， 其针对金 黄色葡萄球菌的isdD基因设计引物组， 能够特异性的识别 金黄色葡萄球菌， 且采取闭管恒 温变色体系， 显色剂直接加入到反应 体系中， 无需开盖， 降低气溶胶污染概 率。 [0007]本发明通过以下技 术方案实现： [0008]第一方面， 本发明提供一种闭管恒温变色检测金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物 组， 检测引物组针对金黄 色葡萄球菌的isdD基因编码序列设计， 检测引物组包括外引物F3、 外引物B3、 内引物FIP、 内引物BIP和环引物LF； [0009]外引物F3的核苷酸序列为： GC CTTTTTACTGAAAAAGGATT， 如SEQ ID NO.1所示； [0010]外引物B3的核苷酸序列： GTA ACGCTTTTTCTTTTTCAACT， 如SEQ  ID NO.2所示； [0011]内引物FIP的核苷酸序列： ATGCTTTAGGTCGCTCATTTTCAATTATTCCT ‑ GTACAAAAAGATAAAGTG， 如SEQ  ID NO.3所示； [0012]内引物BIP的核苷酸序列： ATAGCCCTCCAACAGTAAAAAAGGTGATTT ‑ TTCATCTTTATGTTTCGGT， 如SEQ  ID NO.4所示；说　明　书 1/5 页 3 CN 114540517 A 3