ICS 65.020.40 CCS B 61 广 44 东 省 地 方 标 准 DB44/T 2346—2021 木麻黄青枯菌强致病性菌株筛选技术规程 Technical regulations on screening strains of Ralstonia solanacearum with high pathogenicity to Casuarina spp. 2021 - 12 - 07 发布 2022 - 03 - 07 实施 广东省市场监督管理局  发 布 DB44/T 2346—2021 目 次 前言....................................................................................................................................................................... II 1 范围................................................................................................................................................................... 1 2 规范性引用文件............................................................................................................................................... 1 3 术语和定义....................................................................................................................................................... 1 4 原理与方法....................................................................................................................................................... 1 5 仪器用具........................................................................................................................................................... 2 6 培养基与试剂................................................................................................................................................... 2 7 病菌分离与纯化............................................................................................................................................... 2 8 检测鉴定........................................................................................................................................................... 3 9 菌株鉴定........................................................................................................................................................... 5 10 强致病性菌株筛选......................................................................................................................................... 5 11 菌种保存......................................................................................................................................................... 5 附录 A（资料性） 木麻黄青枯菌......................................................................................................................6 附录 B（规范性） 培养基及试验方法..............................................................................................................7 附录 C（规范性） 试验调查表格....................................................................................................................11 I DB44/T 2346—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由广东省林业局提出、归口，并组织实施。 本文件起草单位：广东省林业科学研究院。 本文件主要起草人：许秀玉、黎明、余玉娟、徐斌、甘先华、王明怀、张应中、张卫强。 II DB44/T 2346—2021 木麻黄青枯菌强致病性菌株筛选技术规程 1 范围 本文件规定了木麻黄青枯菌（Ralstonia solanacearum）分离与纯化、检测鉴定方法、菌株鉴定、 强致病性菌株筛选及菌种保存等技术要求。 本文件适用于木麻黄属植物强致病性青枯菌菌株的筛选。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 4789.28-2013 食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 青枯菌 Ralstonia solanacearum 病害英文名：Bacterial wilt of Casuarina；属细菌界 Bacteria，变形菌门 Proteobacteria，变形菌纲 Betaproteobacteria，伯克氏菌目 Burkholderiales，伯克氏菌科 Burkholderiaceae，青枯 菌属 Ralstonia。 病原菌通过根部从病株蔓延至健株，通过土壤、水流进行远距离传播。 木麻黄青枯菌的其他信息参见附录A。 强致病性 Strong pathogenic ability 能让木麻黄植株迅速感病死亡的能力。 褐梗小枝 Brown lignified twigs 基径2 mm～5 mm的褐色木质化小枝，具多分枝。 分枝 Branch 生长在小枝上的绿色枝条。 小苗 seedling 无性系苗或实生苗，50 cm～70 cm高。 4 原理与方法 1 DB44/T 2346—2021 青枯病菌菌株间存在着显著的致病性差异，且在木麻黄—青枯菌的病理系统中，木麻黄同时存在水 平抗性与垂直抗性，利用不同接种方法、不同抗性植物材料与多菌株交互接种测定的方法，才能准确筛 选出强致病性菌株。 5 仪器用具 仪器 植物生长培养箱、恒温培养箱、恒温振荡培养箱、电子天平（精度≤0.0001 g）、生物显微镜（具 照相系统）、超净工作台、高压灭菌锅、高速冷冻离心机（≥12000 r/min）、PCR仪、电泳仪、电泳槽、 凝胶成像系统、离心机、恒温水浴锅（30 ℃～95 ℃）、低温冰箱、纯水机、涡旋振荡器、分光光度计、 可调微量加样器等。 用具 镊子、手术剪、解剖刀、量筒、烧杯、培养皿、三角瓶、离心管、试管、接种针、接种环等。 6 培养基与试剂 培养基 CPG培养基：按附录B中的B.1规定执行。 TTC培养基：按附录B中的B.2规定执行。 试剂 革兰氏染色试剂：按附录B中的B.3规定执行。 PCR检测所需试剂：按附录B中的B.4规定执行。 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC） 7 病菌分离与纯化 病株判断 小枝黄化，稀疏、凋落，枯枝枯梢多；根系发黑腐烂；木质部局部或全部变褐色至黑褐色；树皮常 纵裂成溃疡状；坏死根茎有水浸臭味；根、主茎、侧枝横切面伤口有乳白色至黄褐色的细菌脓液溢出。 样本采集 挖出病根，剪取直径0.5 cm～1.5 cm、木质部呈水渍状或半透明状主根或侧根2段～3段，每段10 cm～ 20 cm，封口袋封装，记录采集时间、地点，带回实验室分离病菌。 病菌分离 7.3.1 2 稀释分离法 DB44/T 2346—2021 取病根（约3 cm），自来水洗净，75％的酒精浸泡消毒30 s，置无菌水冲洗3次，每次30 s，在超 净工作台上剥去外皮，置于无菌培养皿中切除两端，最后将其横切成3份～5份，放入含有5 ml～10 ml 无菌水的培养皿内30 min，搅拌形成病菌悬浮液。用接种环蘸取菌液在TTC培养基平板上划线分离，至 少3个平板，编号，于30 ℃下恒温培养24 h～48 h。 7.3.2 根系溢出法 将8 cm～10 cm长的病根洗净，两端切成平整的新鲜断面，把其中一端浸泡于装有无菌水中的玻璃 瓶中，室温放置12 h～3