ICS 11.220 CCS B 41 DB42 湖 北 省 地 方 标 准 DB42/T 1779—2021 仔猪肠毒素性大肠杆菌反向间接血凝试验 操作规程 Protocol of reverse indirect hemoagglutination assay for piglet enterotoxigenic escherichia coli 2021 - 12 - 23 发布 湖北省市场监督管理局 2022 - 02 - 23 实施 发 布 DB42/T 1779—2021 目 次 前言 ................................................................................. III 引言 .................................................................................. IV 1 范围 ................................................................................ 1 2 规范性引用文件 ...................................................................... 1 3 术语和定义 .......................................................................... 1 4 仪器与材料 .......................................................................... 1 5 样品的采集和处理 .................................................................... 2 6 实验步骤 ............................................................................ 2 7 结果判定 ............................................................................ 2 8 生物安全 ............................................................................ 2 附录 A（资料性） 仔猪肠毒素性大肠杆菌 K88、K99、987P 纤毛抗原的制备 .................... 3 附录 B（资料性） 培养基和样品稀释液的配制 ............................................. 4 附录 C（资料性） 仔猪肠毒素性大肠杆菌 K88、K99 和 987P 纤毛抗体致敏绵羊红细胞的制备 ..... 5 I DB42/T 1779—2021 II DB42/T 1779—2021 前 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 言 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所提出。 本文件由湖北省农业农村厅归口。 本文件起草单位：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所、华中农业大学。 本文件主要起草人：刘泽文、田永祥、袁芳艳、刘威、高婷、郭锐、杨克礼、周丹娜、梁婉、段正 赢、陈文杰、贝为成。 本 文 件 实 施 应 用 中的 疑问 ，可 咨询 湖北 省农 业农 村厅 ，联 系电 话： 027-87665821，邮箱： hbsnab@126.com； 对本规程的有关修改意见建议请反馈至湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，联系电 话：027-87156122，邮箱：397321935@qq.com。 III DB42/T 1779—2021 引 言 仔猪肠毒素性大肠杆菌腹泻，又称仔猪黄痢，是由仔猪肠毒素性大肠杆菌（Piglet enterotoxigenic escherichia coli，ETEC）引起。该病常发生于1周龄内的仔猪，以1日～3日龄最常见，死亡率可达到 100%，给养猪生产带来极大的危害。由于该病发病急、死亡快，发病后药物治疗效果不佳。为有效预防 和控制本病，急需建立一种快速、敏感、简便的诊断方法。 IV DB42/T 1779—2021 仔猪肠毒素性大肠杆菌反向间接血凝试验 操作规程 1 范围 本文件规定了仔猪肠毒素性大肠杆菌反向间接血凝试验的术语和定义、试验材料、样品的采集和处 理、实验步骤、结果判定和生物安全等。 本文件适用于仔猪肠毒素性大肠杆菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 2839 致仔猪黄痢大肠杆菌分离鉴定技术 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 仔猪肠毒素性大肠杆菌 enterotoxigenic escherichia coli，ETEC 能够产生一种或多种肠毒素的致病性大肠杆菌，是一类可引起初生仔猪腹泻的重要病原菌。 3.2 纤毛抗原 fimbrial antigen 大多数革兰氏阴性菌和少数革兰氏阳性菌的菌体表面遍布的细而短的丝状物，其化学成分 为蛋白 质，具有良好的免疫原性。 4 仪器与材料 4.1 器材 生物安全柜、恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、-40 ℃低温冰箱、普通冰箱、高压灭菌锅、电 子天平（0.001 g）、微量移液器(100 µL、200 µL和1 000 µL)、V型血凝板、手术刀、接种环、酒精灯、 培养皿、三角瓶（100 mL、500 mL和1000 mL）、高速冷冻离心机（12000 r/min）、蛋白质测定仪、磁力 搅拌器。 4.2 实验材料 4.2.1 阳性对照：肠毒素性大肠杆菌纤毛抗原，制备方法见附录 A。 4.2.2 阴性对照：样品稀释液，配制方法见附录 B。 1 DB42/T 1779—2021 4.2.3 4.2.4 5 培养基：改良 Minca 肉汤培养基和麦康凯琼脂培养基，配制方法见附录 B。 大肠杆菌纤毛抗体致敏绵羊红细胞：制备方法见附录 C。 样品的采集和处理 5.1 样品采集、保存及细菌的分离、纯化：按照 NY/T 2839 中的方法执行。 5.2 细菌培养和处理：用无菌接种环挑选单个呈红色或粉色的菌落，接种改良 Minca 肉汤，37 ℃ 100 r/min～120 r/min 振摇培养 8 h～10 h 后收集菌液，室温条件下 5000 r/min 离心 10 min，弃上清，沉淀 用与原菌液等体积的样品稀释液重悬后用于检测。 6 实验步骤 6.1 6.2 6.3 6.4 7 取洁净 V 型血凝板，在样品孔中依次加入待检样品 30 µL/孔。 设置阴性对照和阳性对照各 2 孔，分别加入阴性对照和阳性对照 30 µl/孔。 每孔中加入大肠杆菌 K88（或 K99 或 987P）纤毛抗体致敏红细胞 30 µL/孔。 充分混匀，室温静置 30 min～45 min，观察结果。 结果判定 7.1 实验结果 实验可能出现以下几种结果： 7.2 a) b) c) d) “++++”：100%凝集，致敏绵羊红细胞呈细沙粒样均匀铺于孔底； “+++”：75%凝集，致敏绵羊红细胞均匀铺于孔底，但边缘不整且稍向孔底集中； “++”： 50％凝集，致敏绵羊红细胞于孔底形成一个环状，四周有小凝集块； “+”：25%凝集，致敏绵羊红细胞于孔底形成圆团，但边缘不够光滑，四周稍有凝集； e) “-”：致敏绵羊红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐。 成立条件 阳性对照呈“++++”，阴性对照呈“-”，试验结果成立。 7.3 判定标准 待检样品出现“++”或“++”以上，判定为阳性；待检样品呈现“-”时，判定为阴性；介于两者 之间，判为可疑，对可疑样品重新检测1次，仍然可疑的判为阴性。 8 生物安全 8.1 实验操作人员进行实验前应穿戴好个人防护用品。 8.2 实验过程中涉及到活菌操作，如细菌的分离、纯化和细菌培养和处理等，均应该在生物安全 II 级 实验室内进行。 8.3 实验过程中使用的器材、实验废弃物如病料、活菌及与活菌接触的器皿、枪头、防护手套等，均 应进行无害化处理。 2 DB42/T 1779—2021 A A 附 录 A （资料性） 仔猪肠毒素性大肠杆菌 K88、K99、987P 纤毛抗原的制备 A.1 将含 K88、K99、987P 纤毛的大肠杆菌接种改良 Minca 肉汤，37 ℃振摇培养 8 h～10 h 后收集菌液。 A.2 将收集的菌液，经 5000 r/min 离心 10 min，沉淀物用适量 PBS（0.01 mol/L，pH 值 7.2）悬浮。 A.3 加热至 55 ℃～62 ℃，以 100 r/min～300 r/min 搅拌 20 min～30 min。 A.4 10000 r/min 2 ℃～8 ℃离心 30 min，取上清。加入固体硫酸铵至 30%饱和度，2 ℃～8 ℃放置过 夜。 A.5 10000 r/min 2 ℃～8 ℃离心 30 min，收集沉淀，用少量 PBS（0.01 mol/L，pH 值 7.2）悬浮。 A.6 2 ℃～8 ℃ PBS（0.01 mol/L，pH 值 7.2）透析 24 h～48 h 后，即得到纯化的 K88、K99 和 987P 纤 毛蛋白，测量各纤毛蛋白含量。 3 DB42/T 1779—2021 B B 附 录 B （资料性） 培养基和样品稀释液的配制 B.1 改良 Minca 肉汤培养基 准确称取本品17.5 g，溶解于1000 mL蒸馏水中，加入甘油5 mL，混匀，116 ℃高压灭菌30 min，冷却 后4 ℃保存备用。 B.2 麦康凯琼脂培养基的配制 准确称取本品50.0 g，溶解于1000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min，倾注平板，冷却后4 ℃保存 备用。 B.3 样品稀释液的配制（以下均使用分析纯度试剂） 氯化钠（NaCl） 8.0 g 氯化钾（KCl） 磷酸氢二钠（N