65.020.20 CCS B 22 ICS DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB 32/ T 4139—2021 小麦赤霉病菌抗药性监测技术规程 Technical regulation for monitoring of fungicide resistance in Fusarium spp. causing wheat head blight 2021 - 11 - 04 发布 江苏省市场监督管理局 2021 - 12 -04 实施 发 布 DB32/T 4139-2021 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由南京农业大学提出。 本文件由江苏省农作物标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：南京农业大学、江苏省植物保护植物检疫站。 本文件主要起草人：周明国、侯毅平、段亚冰、王建新、张绍明、朱阿秀。 I DB32/T 4139-2021 小麦赤霉病菌抗药性监测技术规程 1 范围 本文件规定了小麦赤霉病菌抗药性监测对象、敏感性基线确定、采样与分离、敏感性测定等技术要 求。 本文件适用于小麦赤霉病菌对常用杀菌剂抗性监测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 1156.1—2006 农药室内生物测定试验准则 杀菌剂第 1 部分：抑制病原真菌孢子萌发试验 凹 玻片法 NY/T 1156.2—2006 农药室内生物测定试验准则 杀菌剂第 2 部分：抑制病原真菌菌丝生长试验 平 皿法 NY/T 1859.1 农药抗性风险评估第 1 部分：总则 NY/T 1859.6 农药抗性风险评估第 6 部分：灰霉病菌抗药性风险评估 3 术语和定义 NY/T 1859.1 和 NY/T 1859.6 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 区分剂量 critical concentration 能够鉴别抗药性菌株和敏感菌株的药剂浓度。 4 监测对象 监测对象包括： a) 苯并咪唑类杀菌剂：多菌灵、甲基硫菌灵 b) 麦角甾醇生物合成抑制剂：戊唑醇、丙硫菌唑、叶菌唑、丙环唑、三唑酮、咪鲜胺、己唑醇、 氟环唑、苯醚甲环唑 c) 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂：嘧菌酯、吡唑醚菌酯、醚菌酯、烯肟菌酯、肟菌酯 d) 琥珀酸脱氢酶抑制剂：氟唑菌酰羟胺、萎锈灵 e) 肌球蛋白抑制剂：氰烯菌酯 f) 多作用位点杀菌剂：福美双、百菌清 1 DB32/T 4139-2021 5 敏感性基线确定 按照 NY/1859.6 执行。 6 采样与分离 6.1 采样 小麦收获前在多个代表性监测点采集赤霉病发病的麦穗，或在小麦抽穗前 20 至 25 天采集含病残体 的稻桩。采集的每个样本分别装入 1 个纸质信封，并记录采样人及联系方式、采样的小麦品种、用药情 况及地点（省、市县、乡镇、村、组、农户）。做好记录并将样品晾干防止霉变。 6.2 分离 挑取稻桩上的病残体或麦穗上的病麦粒，放在含有 50 μg/mL 五氯硝基苯和 100 μg/mL 硫酸链霉素 的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA，Potato Dextrose Agar）平板上，分离小麦赤霉病菌。 7 敏感性测定 7.1 药剂配制 将有效含量90%以上的杀菌剂原药溶解在合适的溶剂中，制成10 mg/mL的母液，现配现用。 7.2 测定方法 7.2.1 菌丝生长速率测定法 本方法适用于监测对所有登记药剂的抗药性。将分离的小麦赤霉病菌接种至含区分剂量药剂培养基 上，25℃黑暗培养 3 天，观察菌株生长情况，能生长的即为抗性菌株，不生长的即为敏感菌株。具体步 骤按照 NY/T 1156.2—2006。 7.2.2 孢子萌发测定法 本方法适用于监测对甲氧基丙烯酸酯类和琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂的抗药性。制备各菌株的分 生孢子或子囊孢子，用无菌水稀释至约 104-5 个/mL 孢子液，吸取 100 μL 孢子液均匀涂布在含有不同药 剂浓度的水琼脂平板上，在 25ºC 下黑暗培养 6 至 8 小时（对照萌发 95%时），显微镜下检查孢子的萌 发率（芽管长度达孢子宽度的 1/2 即为萌发），计算各菌株的 EC50 值和抗药性指数。具体步骤按照 NY/T 1156.1—2006。 7.2.3 LAMP高通量测定法 本方法适用于监测因小麦赤霉病菌β2-Tubulin的F167Y基因型突变引起的多菌灵抗性。根据LAMP 扩增产物的颜色可判定菌株是否为多菌灵抗性，具体技术方法按照附录A执行。 8 抗药性评价 8.1 抗药性频率及风险评价 抗药性频率（%）=抗药性菌株数/测定菌株数100。抗药性频率 5%以下，为低等风险；抗药性频 2 DB32/T 4139-2021 率为 5%～10%为中等风险；抗药性频率 10%以上为高等风险。 8.2 影响抗药性风险的其他因素 8.2.1 抗药性指数 抗药性指数 5～20，为低等抗性水平；抗药性指数为 20～100 为中等抗性水平；抗药性指数大于 100 为高等抗性水平。抗药性群体的抗药性指数越大，抗性风险越大。 8.2.2 交互抗性模式 当测定到抗性菌株时，则进一步测定其对其他杀菌剂的交互抗性。具体按照 NY/1859.6 执行。若与 其他药剂有交互抗性，则一定程度上加大了抗性风险。 8.2.3 田间种植方式 单一种植同一小麦品种，有利于抗药性群体的发展。 8.2.4 田间气候条件 合适的温度、湿度有利于小麦赤霉病菌的生长、繁殖和侵染，同时也有利于抗药性群体的发展。 9 结果应用 由省农业主管部门发布小麦赤霉病菌抗药性监测结果，指导全省小麦赤霉病化学防控科学用药。 10 抗性菌株及废弃样本的处理 10.1 将抗性菌株 4℃保存于含有 PDA 培养基的冻存管中，以备复测。 10.2 将分离后的样本烧毁或高温灭菌处理，防止抗药性菌株在检测地点扩散。 3 DB32/T 4139-2021 附 录 A （规范性） LAMP 高通量检测小麦赤霉病菌对多菌灵抗药性 （β2-Tubulin 第 167 位氨基酸突变（F167Y）） A.1 DNA 模板制备 用试剂盒将分离的小麦赤霉病菌菌丝体或将含有病原的小麦病粒、或稻桩的子囊壳加入含有 CTAB 提取液的离心管中，用组织研磨机震荡 30 s（28 次/s），在 12000 rpm 离心 3 min，吸取上清加入冰冻 异丙醇沉淀 DNA；12000rpm 离心 3min，弃上清；用 70%的乙醇漂洗 1 次，12000rpm 离心 3min，弃上 清，风干后加无菌水溶解基因组 DNA，备用。 A.2 检测引物 F3: TTCCAGCTGACGCACTCT B3: ACAGAAGGTCTCGTCAGAGT FIP: TGCGATCGGGGAACTCCTCG-TGGTACCGGTTCCGGTATG BIP: AAACCGTTATGCCCTCGCCC-ACGAGCTGGTTCAGAGACAA A.3 反应体系与条件（10 μL） Bst DNA 聚合酶（8U/μL）0.3 μL；10×ThermoPol 1.0 μL；MgCl2（25mM） 1.6 μL；dNTP（10 mM） 1.0 μL；FIP（40 μM） 0.4 μL；BIP（40 μM）0.4 μL；F3（10 μM） 0.2 μL；B3（10 μM） 0.2 μL；甜 菜碱（8 M） 1.2 μL；HNB（2.5 mM） 0.6 μL；基因组 DNA 0.5 μL；dH2O（灭菌蒸馏水） 2.6 μL。反 应参数：63℃ 60 min，80℃ 10 min。 按照上述反应体系在恒温水浴锅中 63℃反应 60 min，80℃ 10 min 终止反应，对上述 LAMP 扩增产 物观察其颜色变化，鉴定是否为多菌灵中抗的禾谷镰孢菌菌株；如果 LAMP 扩增产物显示天蓝色，判 定为多菌灵中抗（F167Y）的禾谷镰孢菌菌株；如果扩增产物为紫色，判定为敏感菌株。 __________________________ 4