(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210232204.2 (22)申请日 2022.03.09 (71)申请人 南京林业大 学 地址 210018 江苏省南京市玄武区龙蟠路 159号 申请人 南京海关动植物与食品检测中心 (72)发明人 戴婷婷　周紫薇　杨静　钱茱希　 吴翠萍　 (74)专利代理 机构 镇江至睿专利代理事务所 (普通合伙) 3252 9 专利代理师 刘静 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 杜鹃根腐病病原菌的特异性检测靶标 Ppini_05588及应用 (57)摘要 本发明公开了一种引起杜鹃根腐病的病原 菌Phytophthora  pini的特异性检测靶标Ppini_ 05588， 该检测靶标Ppini_05588的DNA序列如SEQ   ID NO： 1所示， CDS序列如SEQ  ID NO:1所示， 蛋白 序列如SEQ  ID NO： 2所示。 同时， 还公开了特异性 检测靶标Ppini_05588的引 物对， 其正向引 物序 列如SEQ ID NO： 3所示， 反向引物序列如SEQ  ID  NO： 4所示。 本发明所发掘的检测靶标和其设计的 引物对用于普通PCR， 其特异性强， 灵敏度高， 为 杜鹃根腐病的病原菌P.pini的检测提供了新的 技术方法。 权利要求书1页 说明书12页 序列表6页 附图2页 CN 114457186 A 2022.05.10 CN 114457186 A 1.一种引起杜鹃根腐病病原菌P.pini的特异性检测靶标Ppini_05588， 其特征在于， 所 述检测标靶的DNA序列如SEQ  ID NO： 1所示。 2.一种检测杜鹃根腐病病原菌P.pini的引物对， 其特征在于， 所述引物对包括正向引 物和反向引物， 所述正向引物Ppi05588  PCR‑F1序列如SEQ  ID NO： 3所示， 反向引物 Ppi05588 PCR‑R1序列如SEQ  ID NO： 4所示。 3.权利要求2所述的引物对在检测杜鹃根腐病 病原菌P.pi ni中的应用。 4.一种检测杜鹃根腐病病原菌P.pini的试剂盒， 其特征在于， 至少包括1次用量的含有 权利要求3所述的引物对的检测溶 液， 其中所述引物组合浓度为20 μM 。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述检测溶液还包括： 4种dNTP各2000μ M， 100 μL 10×PCR反应缓冲液， 80mM  Mg2+， 100 μL 1％BSA， 5 0单位Taq酶。 6.权利要求 4‑5任一所述的试剂盒在检测杜鹃根腐病 病原菌P.pi ni中的应用。 7.一种检测杜鹃根腐病病原菌P.pini的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 取1μL检测 对象的DNA溶液， 加入23 μL权利要求5中所述的检测溶液和1μL灭菌去离子水， 总体积为25 μ L； PCR扩增程序为94℃变性3分钟， 94℃变性30秒钟； 58℃退火30秒； 72℃延伸45秒钟； 33个 循环， 最后72℃延伸10分钟。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114457186 A 2杜鹃根腐病 病原菌的特异性检测靶标Ppini_05 588及应用 技术领域 [0001]本发明属于杜鹃根腐病病原菌检测技术领域， 具体涉及杜鹃根腐病病原菌 Phytophthora  pini的特异性检测靶标Ppi ni_05588及应用。 背景技术 [0002]Phytophthora  pini是一种重要的卵菌植物病原体， P.pini能够引起杜鹃根部的 腐烂以及 枝干溃疡。 目前已发现P.pini能在杜鹃、 挪威云杉、 杨 树、 欧洲山毛榉树、 橄榄树等 植物上致病。 目前对该病还没有有效的防治措施， 防止病原菌的传播扩散是控制该病的最 有效措施。 因此为了更有效地检测该病菌， 建立快速检测方法， 为病害的风险及研究决策提 供依据， 从而 有利于降低该病害的发生对生态 环境的保护起到一定的作用。 [0003]传统的卵菌分类鉴定主要是基于形态学特征、 致病性测定、 生理生化特征等。 传统 的分离疫腐霉的方法采是用诱捕法从土壤、 灌溉水和 植物材料中分离。 传统方法在疫霉菌 的检测中发挥了重要作用， 但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉菌分离、 形态学 鉴定知识和丰富的经验； 同时传统分类鉴定方法耗时长、 灵敏度低、 易受人为及环境等诸多 因素的干扰， 不能在病害潜伏期和发病初期做出诊断， 很难对病害发生进行及时的监测和 有效控制 。 所以为了快速并准确的检测到病原菌， 发掘特异性好的靶基因是目前所有检测 技术的核心。 不同的靶标序列检测的特异性和灵敏度存在一定的差距， 因选择 的目标靶序 列不同、 片段大小不同， 结果 都会有很大差别。 靶标基因的选择要确保其在种内的不同菌株 间的高度保守， 而在种间变异性较高。 [0004]综上所述， 发掘高信赖度特异性分子检测靶标并基于新靶标建立灵敏、 准确的检 测技术体系对提升对杜鹃根腐病病原菌P.pini的快速分子检测 研究及其检测时所致病害 早期诊断具有重要作用。 发明内容 [0005]针对现有技术中的技术问题， 本发明提供一种杜鹃根腐病病原菌P.pi  ni的检测 靶标Ppini_05588及基于新检测靶标其PCR检测引物组合物。 本发 明的另一目的是提供上述 杜鹃根腐病 病原菌P.pi ni的PCR检测试剂盒。 [0006]第一方面， 本发明提供了一种引起杜鹃根腐病病原菌P.pini的特异性检测靶标 Ppini_05588， 所述检测标靶的DNA序列如SEQ  ID NO： 1所示。 [0007]第二方面， 本发明提供了一种检测 杜鹃根腐病病原菌P.pini 的引物对， 所述引物 对包括正向引物和反向引物， 所述正向引物Ppi05588  PCR‑F1序列如SEQ  ID NO： 3所示， 反 向引物Ppi0 5588 PCR‑R1序列如SEQ  ID NO： 4所示。 [0008]第三方面， 本 发明提供了第二方面所述的引物对在 检测杜鹃根腐病病原菌P.pini 中的应用。 [0009]第四方面， 本发明还提供了一种检测 杜鹃根腐病病原菌P.pini 的试剂盒， 至少包 括1次用量的含有本发明第二方面所述的引物对的检测溶液， 其中所述引物组合浓度为20 μ说　明　书 1/12 页 3 CN 114457186 A 3