(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210255990.8 (22)申请日 2022.03.15 (71)申请人 北京华诺奥美 基因医学检验实验室 有限公司 地址 100000 北京市大兴区中关村科技园 区大兴生物医药产业基地永旺西路26 号院13号楼1层101室 （集群注 册） (72)发明人 张鑫　魏星　 (74)专利代理 机构 成都顶峰专利事务所(普通 合伙) 51224 专利代理师 钱学宇 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6804(2018.01) C12Q 1/04(2006.01)C12N 15/11(2006.01) G01N 33/569(2006.01) G01N 33/577(2006.01) G01N 33/58(2006.01) G01N 33/558(2006.01) G01N 33/543(2006.01) (54)发明名称 用于检测肺炎克雷伯菌的PCR引物、 试剂盒 及检测方法 (57)摘要 本发明提供一种用于检测肺炎克雷伯菌的 PCR引物、 试剂盒及检测方法， 属于生物检测技术 领域。 该PCR引物包括正向引物和反向引物， 正向 引物的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示， 反向引 物的核苷酸序列如SEQ  ID No.2所示。 本发明提 供的这种试纸条以及试剂盒， 利用对肺炎克雷伯 菌phoE基因有特异性的PCR引物， 能够对肺炎克 雷伯菌核酸进行快速、 简便、 准确、 高灵敏度(最 低检测限为2 ×102copies/mL)的检测， 用于快速 判断是否感染肺炎克雷伯菌， 无需微生物培养过 程， 不需昂贵仪器， 可作为肺炎克雷伯菌感染的 临床快速 辅助诊断。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图1页 CN 114517236 A 2022.05.20 CN 114517236 A 1.一种用于检测肺炎克雷伯菌的PCR引物， 其特征在于， 所述PCR引物包括正向引物和 反向引物， 所述正向引物的核苷 酸序列如SEQ  ID No.1所示， 所述反向引物的核苷 酸序列如 SEQ ID No.2所示。 2.根据权利要求1所述的用于检测肺炎克雷伯 菌的PCR引物， 其特征在于， 所述正向引 物的5’端标记有生物素， 所述反向引物的5 ’端标记有荧 光素； 优选地， 所述 荧光素包括FITC、 FAM或TAMRA。 3.一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒， 其特征在于， 其包括： 肺炎克雷伯菌检测液、 PCR反 应液、 阳性对照品、 阴性对照品以及 胶体金核酸检测试纸条； 其中， 所述肺炎克 雷伯菌检测液中含有如权利要求1或2所示的PCR引物。 4.根据权利要求3所述的检测肺炎克雷伯菌的试剂 盒， 其特征在于， 所述胶体金核酸检 测试纸条固定在PVC底板上， 所述胶体金核酸检测试纸条包括依次相连接的样品垫、 胶体金 垫、 硝酸纤维素膜和吸水垫； 所述胶体金垫上包被有胶体金 标记的抗 生物素抗体。 5.根据权利要求4所述的检测肺炎克雷伯菌的试剂 盒， 其特征在于， 所述硝 酸纤维素膜 上设有检测区和质控区， 所述检测区包被荧 光素单克隆抗体， 所述质控区包被抗鼠抗体。 6.根据权利要求3所述的检测肺炎克雷伯菌的试剂 盒， 其特征在于， 所述肺炎克雷伯菌 检测液中所述PCR引物的浓度为5 0～400nM。 7.一种肺炎克雷伯菌的胶体金免疫层析检测方法， 其特征在于， 其利用如权利要求3～ 6任一项所述的试剂盒进行， 包括： 将从待测样品中提取的DNA模板置于具有所述PCR引物的PCR扩增体系中， 进行PCR反应 得到扩增产物； 将所述扩增产物稀释后 滴加至所述胶体金核酸检测试纸条的样品垫上， 通过显色有无 判断所述待测样品中是否含有肺炎克 雷伯菌。 8.根据权利要求7所述的肺炎克雷伯菌的胶体金免疫层析检测方法， 其特征在于， 所述 PCR扩增体系总量25 μL， 包括： 2 μL的所述肺炎克雷伯菌检测液、 12.5 μL的PCR反应液、 1μL的 DNA模板以及9.5 μL的d dH2O。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114517236 A 2用于检测肺炎克雷伯菌的PCR引物、 试剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物检测技术领域， 具体涉及一种用于检测肺炎克雷伯菌的PCR引物、 试剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]肺炎克雷伯菌(Klebsiella  pneumoniae， KP)， 是一种革兰氏阴性菌， 不运动的、 包 囊的杆状芽孢杆菌， 存在于人类和非人类灵长类动物的鼻咽和胃肠道中， 属于克雷伯氏菌 属和肠杆菌科， 兼性厌 氧， 是肠杆菌科克雷伯氏菌属中最为重要的一类菌， 其所致疾病占克 雷伯氏菌属感染的95％以上。 当机体免疫力降低时， 可经呼吸道进入肺内引发典型的原发 性肺炎。 肺炎克雷伯菌是引起医院获得性肺炎的重要病原体， 尤其在革兰氏阴性杆菌肺部 感染中， 仅次于流感嗜血杆菌， 排在第2位， 同时也是社区获得性感染如社区获得性肺炎的 潜在病原体。 肺部病变中渗出液粘稠而重， 致使叶间隙下坠。 克雷伯氏菌对外界抵抗力强， 对多数抗生素易产生耐药性。 除引起重症肺炎外， 还可引起泌尿道感染、 胆道感染、 败血症 和化脓性脑 膜炎等严重疾病。 [0003]医院肺炎克雷伯菌标本主要来源为痰液、 尿液、 分泌物、 血液。 目前检测肺炎克雷 伯菌感染的方法主要包括细菌培养 法、 血清学检测和实时荧光定量P CR等分子诊断方法。 微 生物培养法耗时3d左右， 且培养条件复杂， 不利于早期诊断和治疗。 荧光定量PCR技术虽然 在临床应用中具有灵敏度高、 特异 性强等特点， 但对实验人员技术要求高， 需要 具备专业的 实验技能和知识背景， 并且需要昂贵的qPCR仪器， 使得很多核酸检测试剂盒无法普及到基 层医院， 限制了其推广和应用。 常规P CR技术虽然 无需昂贵仪器， 但获得核酸扩增产 物后， 需 要通过琼脂糖凝胶电泳判断阴阳性， 操作费时、 繁琐。 因此， 临床上需要一种操作简 便、 快速 以及准确的鉴定方法。 [0004]市面上应用胶体金免疫层析技术开发出的检测试剂盒的检测靶标大部分都为抗 体或抗原， 这些以检测蛋白为 目的的检测试剂盒需要大量单克隆抗体制备， 成本昂贵且制 备周期长， 检测特异性易受到样本基质的影响， 在疾病窗口期的病原体检出率方面不具备 优势。 发明内容 [0005]本发明针对目前肺炎克雷伯菌检测方法的上述弊端， 提供一种用于检测肺炎克雷 伯菌的PCR引物、 试剂盒及检测方法。 本发明提供的这种试剂盒， 利用针对肺炎克雷伯菌 phoE基因特异 性的PCR引物， 能够对肺炎克雷伯菌核酸进行快速、 简 便、 准确、 高灵敏度的检 测。 用于快速判断是否感染肺炎克雷伯菌， 无需微生物培养过程， 不需昂贵仪器， 可作为肺 炎克雷伯菌感染的临床快速 辅助诊断。 [0006]本发明通过以下技 术方案实现： [0007]第一方面， 本发明提供一种用于检测肺炎克雷伯菌的PCR引物， PCR引物包括正向 引物和反向引物， 正向引物的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示， 反向引物的核苷酸序列如说　明　书 1/6 页 3 CN 114517236 A 3