(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210272056.7 (22)申请日 2022.03.18 (71)申请人 湖南农业大 学 地址 410128 湖南省长 沙市芙蓉区农大路1 号 (72)发明人 朱俊子　钟杰　李晓刚　马雅敏　 (74)专利代理 机构 四川云首创专利代理事务所 (普通合伙) 51359 专利代理师 万利 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/77(2006.01) (54)发明名称 一种叶斑菌病原菌LAMP检测引物、 试剂盒及 LAMP快速 检测方法 (57)摘要 本发明提供一种叶斑病病原菌的LAMP检测 引物， 涉及植物病原菌检测的技术领域， 所述引 物包括正向外引物F3、 反向外引物B3、 正向内引 物FIP和反向内引物BIP， 所述引物系列如下： F3： 5’‑ACCAGTGCGGTGGTATCG ‑3’； B3： 5’‑ CAAGAGCGCCTGTCACTC ‑3’； FIP ： 5 ’‑ G G A T C G A T G G G A A G A A G G G C G C A A G C G A A C C A T C G A G A A G T ‑3’； B I P ： 5 ’‑ CATACGACGACTCGACAAGCGCCCACCACCCAAAAAAACGA C‑3’。 权利要求书2页 说明书6页 序列表1页 附图4页 CN 114480722 A 2022.05.13 CN 114480722 A 1.一种叶斑病 病原菌的LAMP检测引物， 其特 征在于： 所述引物包括正向外引物F3、 反向外引物B3、 正向内引物FIP和反向内引物BIP， 所述引 物系列如下： F3： 5’ ‑ACCAGTGCGGTGGTATCG‑3’； B3： 5’ ‑CAAGAGCGCCTGTCACTC ‑3’； FIP： 5’ ‑GGATCGATG GGAAGAAGGGCGCAAGCGAACCATCGAGA AGT‑3’； BIP： 5’ ‑CATACGACGACTCGACA AGCGCCCACCACCCAAAAAAACGAC‑3’。 2.一种叶斑病 病原菌的LAMP检测试剂盒， 其特 征在于， 包括权利要求1所述的引物。 3.根据权利要求2所述的叶斑病病原菌的LAMP检测试剂 盒， 其特征在于： 试剂盒还包括 dNTPs、 Bst  DNA聚合酶、 10 ×isothermal  amplificationbuffer和MgSO4。 4.一种包 含权利要求1所述引物的叶斑病 病原菌的LAMP检测反应 体系， 其特 征在于： 反应体系包括： 10uM的FIP和BIP引物各4μL， 10uM  F3和B3引物各0.5μL， 10mM  dNTPs  2.5 μL， 8U/ μL  Bst DNA聚合酶1 μL， 50mM  MgSO44 μL， 10×isothermal  amplificationbuffer   2.5 μL， 用灭菌超纯 水补平至25 μL。 5.一种基于权利要求4所述反应体系的叶斑病病原菌的LAMP检测方法， 其特征在于， 包 括以下步骤： S1： 获取叶斑病 病原菌的EF ‑1α 基因保守区利用Primer  Explore V5在线设计引物； S2： 制备25 μL的权利要求 4中的检测反应 体系； S3： 将待测样品总DNA于S2所述的检测 反应体系中进行LAMP扩增， 反应结束后， 取反应 产物； S4： 将反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测； 或/和用SYBR  GreenI染料观察LAMP反应液变 化； S5： LAMP反应产物在琼脂糖凝胶电泳出现连续呈弥散状条带为阳性， 存在叶斑菌病原 菌； 和/或反应液呈现翠绿色为阳性， 存在叶斑病病原菌， 淡橙色为阴性， 不存在叶斑病病原 菌。 6.根据权利要求5所述的LAMP检测方法， 其特征在于， 所述反应体系中的反应条件为： 温度为60℃、 反应时间为6 0min。 7.根据权利要求5所述的LAMP检测方法， 其特 征在于， 所述S1中获取叶斑病 病原菌的操作步骤如下： 步骤一： 剪取罹病叶片病健交界部分的组织进行消毒， 再用无菌水漂洗， 用无菌滤纸吸 干水分后将其 放置于含有链霉素的P DA平板上， 26℃黑暗培 养； 步骤二： 将长出的菌落转接至PDA培养基， 通过单孢分离进行纯化后用PDA斜面保存于4 ℃备用， 得到分离纯化的菌株。 8.根据权利要求7所述的LAMP检测方法， 其特征在于， 还包括对叶斑病病原菌的鉴定， 包括以下步骤： Sa： 将分离纯化的菌株接种于P DA培养基中培 养出菌丝， 然后提取真菌DNA； Sb： 通过引物ITS4/ITS5和EF1 ‑728F/EF1‑986R扩增核糖体转录间区和翻译延长因子基 因部分序列； Sc： 构建PCR反应体系， 该PCR反应体系为2 ×Es Taq Master Mix25 μL、 总DNA模板2 μL、权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114480722 A 210 μM上下游引物各2 μL、 d dH2O 19 μL， 扩展反应取反应产物； Sd： 反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测后， 进行序列测定， 获序列在NCBI数据库进行 BLASTN比对分析， 利用M EGA6软件中邻接法构建系统发育树。 9.根据权利要求8所述的LAMP检测方法， 其特征在于， PCR反应条件94℃预变性5min； 94 ℃变性30s， 56℃退火3 0s， 72℃延伸1mi n， 共35个循环； 最后72℃延伸10mi n， 4℃保存。 10.根据权利要求2所述的试剂 盒在植物叶斑菌病原菌鉴定中的应用， 所述植物为黄花 菜。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114480722 A 3