(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210290463.0 (22)申请日 2022.03.23 (71)申请人 陕西师范大学 地址 710062 陕西省西安市长安 南路199号 (72)发明人 刘永峰　张雪茹　郝果　乔春艳　 (74)专利代理 机构 西安永生专利代理有限责任 公司 61201 专利代理师 高雪霞 (51)Int.Cl. C12Q 1/6876(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) A23C 7/04(2006.01) A23C 9/14(2006.01) A23C 9/142(2006.01)A23C 21/00(2006.01) (54)发明名称 基于生乳的冷冻干燥羊乳清粉真实性检测 方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于生乳的冷冻干燥羊 乳清粉真实性检测方法， 该方法首先从牛、 羊乳 中分别提取分离并冷冻干燥获取牛、 羊乳清粉， 然后对两者按比例混合后的标准样品分别提取 DNA， 再利用实时荧光定量PCR技术对含有牛乳清 粉的标准样品扩增牛基因组DNA， 建立定量标准 曲线， 得到Ct值与牛乳清粉质量百分含量的对数 值间的关系式； 接着对待测样品提取DNA后利用 普通PCR进行初步定性， 然后利用实时荧光定量 PCR技术扩增牛基因组DNA获得的Ct值代入标准 曲线的关系式中可确定牛乳清粉的含量。 本发明 为羊乳清粉掺入牛乳清粉成分的检测提供了一 种方法， 对于羊乳制品的安全品质检测具有重要 的意义。 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 114525327 A 2022.05.24 CN 114525327 A 1.一种基于生乳的冷冻干燥羊乳清粉真实性检测方法， 其特征在于它由以下步骤组 成： (1)将新鲜牛乳和羊乳在0～4℃下以5000～8000r/min离心20～30min， 去除上层脂肪 保留下层 脱脂乳， 在75～90℃下进行热灭菌15～16 s， 然后将所得脱脂牛奶和羊奶的pH值分 别调节至4.6和4.1以去除酪蛋白， 经室温静置1h后， 在3000～5000r/min下离心15～20min 收集上清液， 将上清液通过0.45 μm过滤器过滤脂肪球， 并通过5000Da超 滤膜去除乳糖， 所得 乳清浸入62～65℃水浴中灭菌30min， 最后通过真空冷冻干燥分别 得到牛乳清粉和羊乳清 粉； (2)将步骤(1)得到的牛乳清粉和羊乳清粉混合， 配制不同牛乳清粉质量百分含量的标 准样品； 提取标准样品的DNA， 并用TE缓冲溶液将提取的标准样品DNA浓度标准化为50～ 100ng/ μL； (3)以步骤(2)标准化的标准样品DNA为模板， 利用牛线粒体DNA的Bos ‑Cytb基因的特异 性引物进 行荧光定量P CR扩增， 并获得不同牛乳清粉质量百分含量对应的Ct 值， 建立定量标 准曲线， 得到 Ct值与牛乳清粉质量百分含量的对数值间的关系式； 上述牛线粒体DNA的Bos ‑Cytb基因的特异性引物的序列如下： 上游引物： 5 ’—GCCATATACTCTC CTTGGTGACA—3 ’ 下游引物： 5 ’—GTAGGCTTGGGAATAGTACGA—3 ’ (4)提取待检测样品的DNA， 并用TE缓冲溶液将提取的待检测样品DNA浓度标准化为与 标准样品DNA相同的浓度； 然后将标准化的待检测样品DNA采用步骤(3)所述牛线粒体DNA的 Bos‑Cytb基因的特异性引物进行普通PCR扩增， 获得的电泳图对待测样品进 行初步定性； 若 未检测出牛乳清粉， 结束操作； 若检测出有牛乳清粉， 则按照步骤(3)的方法进行荧光定量 PCR扩增， 得到待测样品对应的Ct值， 代入步骤(3)的关系式中， 即得到待测样品中牛乳清粉 含量。 2.根据权利要求1所述的基于生乳的冷冻干燥羊乳清粉真实性检测方法， 其特征在于： 步骤(1)中， 用食品级NaOH和H Cl将所得脱脂牛奶和羊奶的pH值分别调节至4.6和4.1。 3.根据权利要求1所述的基于生乳的冷冻干燥羊乳清粉真实性检测方法， 其特征在于： 步骤(2)中， 按照牛乳清粉质量百分含量为0.1％、 0.5％、 1％、 5％、 10％和30％， 将步骤(1) 得到的牛乳清粉和羊乳清粉混合， 配制标准样品。 4.根据权利要求1所述的基于生乳的冷冻干燥羊乳清粉真实性检测方法， 其特征在于： 步骤(3)中， 所述荧光定量PCR扩增的条件为： 95℃预变性10min； 95℃变性10s， 60℃退火 30s， 72℃延伸3 0s， 40个循环。 5.根据权利要求1所述的基于生乳的冷冻干燥羊乳清粉真实性检测方法， 其特征在于： 步骤(4)中， 所述普通PCR扩增的条件为： 95℃预变性10min； 95℃变性30s， 52℃退火30s， 72 ℃延伸30s， 共30个循环； 72℃总延伸10mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114525327 A 2基于生乳的冷冻干 燥羊乳清粉真实性检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于食品安全检测技术领域， 具体涉及一种从生乳中提取分离的羊乳清粉 的真实性检测方法。 背景技术 [0002]牛乳清粉保 留了牛乳中约55％的营养成分， 近年来成为了一种流行的膳食蛋白质 补充剂， 它可以调节蛋白质比例以减轻婴幼儿肾脏的负担， 其次， 一些过敏成分可以通过酶 水解减少到最低限度。 因此， 牛乳清粉常被添加在婴幼儿配方奶粉和医疗营养配方奶粉中， 占40％～50％， 已经成为婴幼儿配方奶粉中的主要成分之一。 羊乳清粉的价格虽然相 对低 于羊奶粉， 然而由于奶山羊养殖规模小、 产量低， 羊乳清粉的价格远高于牛乳清粉， 其次牛 乳清粉的价格比牛奶便宜90％。 在利益的驱使下， 这使得牛乳清粉成为纯山羊奶制品中掺 假的主要目标。 这不但会给羊奶粉行业带来不 公平竞争， 欺骗广大消费者， 甚至对于牛乳过 敏的人群来说， 如果食用了掺有牛乳清粉的纯山羊奶制品， 可能存在健康风险。 因此， 尽快 研究出准确检测牛乳清粉成分含量， 准确评定羊乳粉纯正性的方法， 成为消费者、 羊乳制品 生产企业和食品安全监管部门的迫切需要。 [0003]目前关于牛乳清粉检测的方法包括光谱技术、 质谱和免疫学方法， 从原理来看， 它 们是通过判别维生素、 脂肪和蛋白质之 间的差异， 从而达到鉴别牛乳清粉的目的， 但这些方 法却各有不 足， 光谱技术检测成本高且仪器操作复杂， 质谱在结构分析中存在一定的难度， 免疫学技术中的单克隆抗体制备 的难度相对较大。 其次， 乳清粉在生产加工过程中由于受 到热处理， 这些成分不仅会发生变化， 而且也会降低检测灵敏度。 [0004]基于DNA分子生物学的PCR技术 由于具有极高的灵敏度、 稳定性和 可重复性， 在掺 假检测中已经成为主流的检测技术。 然而， 目前国内外在牛乳清粉的定性定量检测研究方 面鲜有涉及。 发明内容 [0005]针对现有技术中鉴别牛乳清粉的缺陷和不足， 本发明的目的在于提供一种基于生 乳的冷冻干燥羊乳清粉真实性检测方法， 可适用于热处 理后的牛乳清粉鉴别。 [0006]为了实现上述目的， 本发明所采取的技 术方案由以下步骤组成： [0007]1.将新鲜牛乳和羊乳在0～4℃下以5000～8 000r/min离心20～30 min， 去除上层脂 肪保留下层 脱脂乳， 在75～90℃下进 行热灭菌15～16s， 然后将所得脱脂牛奶和羊奶的pH值 分别调节至4.6和4.1以去除酪蛋白， 经室温静置1h后， 在3000～5000r/min下离心15～ 20min收集上清液， 将上清液通过0.45μm过滤器过滤脂肪球， 并通过5000Da超滤膜去 除乳 糖， 所得乳清浸入62～65℃水浴中灭菌30min， 最后通过真空冷冻干燥分别得到牛乳清粉和 羊乳清粉。 [0008]2.将步骤1得到 的牛乳清粉和羊乳清粉混合， 配制不同牛乳清粉质量百分含量的 标准样品； 提取标准样 品的DNA， 并用TE缓冲溶液将提取的标准样 品DNA浓度标准化为50～说　明　书 1/3 页 3 CN 114525327 A 3