(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210295102.5 (22)申请日 2022.03.23 (71)申请人 华南农业大 学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483号 (72)发明人 谢青梅　张新珩　巫秀红　姚梓淇　 陈丽怡　 (74)专利代理 机构 西安正华恒远知识产权代理 事务所(普通 合伙) 61271 专利代理师 陈选中 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于禽白血病病毒P12 基因的RT-RAA荧光法 检测的引物对、 试剂盒及检测方法 (57)摘要 本发明提出了一种用于禽白血病病毒P12基 因的RT‑RAA荧光法检测的引物对、 试剂盒及检测 方法， 该引物对包括正向引物和反向引物； 正向 引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 反向引 物的核苷酸序列如SEQ  IDNO.2所示。 本发明提供 的引物对可以特异性扩增禽白血病病毒P12基 因， 利用该引物对可以特异性检测禽白血病病 毒， 检测周期更短且特异性更强。 权利要求书1页 说明书8页 附图3页 CN 114703322 A 2022.07.05 CN 114703322 A 1.一种用于禽白血病病毒P12基因的RT ‑RAA荧光法检测的引物对， 其特征在于， 包括正 向引物和反向引物， 所述正向引物的核苷 酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述反向引物的核苷 酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 2.一种如权利要求1所述的用于禽白血病病毒P12基因的RT ‑RAA荧光法检测的引物对 在制备用于检测禽白血病 病毒的试剂和试剂盒中的应用。 3.一种用于检测禽白血病病毒的试剂盒， 其特征在于， 包括如权利要求1所述的引物 对。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括针对所述禽白血病病毒P12基因 设计的探针， 所述探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示。 5.根据权利要求3或4所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括阳性对照品， 所述阳性对照品 包括含有禽白血病病毒SD1005的核酸， 所述含有禽白血病病毒SD1005的核酸的扩增碱基序 列如SEQ ID NO.4所示。 6.根据权利要求3或4所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括阴性对照品， 所述阴性对照品 包括ddH2O。 7.一种检测禽白血病病 毒的方法， 其特征在于， 包括如下步骤， 选取待测样本并提取所 述待测样本的RNA， 得到RNA样本， 使用如权利要求2 ‑5任意一项所述的试剂盒对所述RNA样 本进行RT ‑RAA反应。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述RNA样本经过RT ‑RAA反应后得到扩增 产物， 当所述扩增产物的出峰时间≤20min 或Ct值≤39时， 所述待测样 本为禽白血病病毒 阳 性， 当所述扩增产物的出峰时间＞20min或Ct值＞39时， 所述待测样本为禽白血病病毒阴 性。 9.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述试剂盒中的正向引物、 反向引物和探 针的工作浓度均为10 μM 。 10.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述RT ‑RAA的反应温度为39 ‑42℃， 所述 RT‑RAA的反应时间为25 ‑30min。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114703322 A 2用于禽白血病 病毒P12基因的RT ‑RAA荧光法检测的引物对、 试 剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学技术领域， 具体而 言， 涉及一种用于禽白血病病毒P12基因 的RT‑RAA荧光法检测的引物对、 试剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]禽白血病(Avian  leukemia)是 由隶属反转录病毒科， C型反转录病毒属的禽白血 病病毒(Avian  leukosis  virus， ALV)引起的， 在临床上主要以免疫抑制、 生长抑制和多器 官组织出现肿瘤为特征， 免疫抑制还会造成继发感染， 影响生产性能， 造成鸡淘汰与死亡， 给全球的家禽养殖业带来 严重的经济损失。 [0003]根据ALV囊膜蛋白的特异性、 宿主范围、 传播途径以及血清学交叉反应的不同将 ALV分别命名为ALV ‑A到ALV‑J， 其中A、 B、 C、 D、 K、 E以及J亚群来源于鸡。 E亚群为内源性病毒， 其致病能力较低甚至没有致病 性， 但在鸡群中广泛存在； A、 B、 C、 D、 K以及J亚群为外源性病 毒， 引起临床肿瘤性疾病以及严重的继 发反应。 [0004]ALV作为逆转录病毒， 其基因组很容易在不同的亚群之间重组并且整合在宿主的 染色体基因组内， 从而导致常规检测上出现假阳性的现状。 我国针对ALV实行净化方案， 在 净化方案的中使用的检测标准是病毒分离， 需要在DF ‑1细胞中培养7 ‑9天， 再用ELISA试剂 盒辅助检测细胞培养上清中p27特异性抗原。 这种方法在实际操作中， 检测周期长， 需要高 素质的专业人员和设备才能进行这项试验。 发明内容 [0005]本发明的第一目的在于提供一种用于禽白血病病毒P12基因的RT ‑RAA荧光法检测 的引物对， 其能够解决现目前结果不精确， 容易出现因禽白血病毒基因组整合到宿主基因 组引起的假阳性现象这 一技术问题。 [0006]本发明的第二目的在于提供一种用于禽白血病病毒P12基因的RT ‑RAA荧光法检测 的引物对在制备用于检测禽白血病 病毒的试剂和试剂盒中的应用。 [0007]本发明的第三目的在于提供一种用于检测禽白血病病毒的试剂盒， 其能够解决现 目前检测耗时长且操作复杂这 一技术问题。 [0008]本发明的第四目的在于提供一种检测禽白血病病毒的方法， 该方法使用上述试剂 盒进行检测， 不仅能够大 大缩短检测时间， 还能够有效提高检测的准确性及效率。 [0009]本发明解决其 技术问题是采用以下技 术方案来实现的。 [0010]第一方面， 本申请提供了一种用于禽白血病病毒P12基因的RT ‑RAA荧光法检测的 引物对， 包括正 向引物和反向引物， 正向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 反向引物 的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 本发 明提供的引物对 可以特异性扩增禽白血病病毒， 与 新城疫病毒、 禽传染性支气管炎病毒、 马立克氏病毒、 禽传染性法氏囊病毒、 禽网状内皮组 织增生症病毒和H9N2亚型禽流感病毒的核酸均无交叉反应， 特异性强。 利用该引物对可以说　明　书 1/8 页 3 CN 114703322 A 3