(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210331826.0 (22)申请日 2022.03.31 (71)申请人 广西科学院 地址 530007 广西壮 族自治区南宁市西乡 塘区大岭路98号 申请人 广西大学 (72)发明人 王佳乐　王英辉　赖俊翔　李杰　 许铭本　陆家昌　 (74)专利代理 机构 南宁智卓专利代理事务所 (普通合伙) 4512 9 专利代理师 苏惠 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/89(2006.01) (54)发明名称 一种定量分析赤潮暴发早期单细胞球形棕 囊藻的方法 (57)摘要 本发明公开了一种定量分析赤潮暴发早期 单细胞球形棕 囊藻的方法， 包括引物和探针的设 计与合成， 样品基因DNA提取， 采用引物和探针配 置荧光定量PCR定量体系以及构建定量标准曲 线， 并进行荧光定量PCR检测。 将提取的核 酸溶液 所测得的Ct值带入定量标曲方程式， 即可对单细 胞球形棕囊藻定量。 本发明提供定量分析赤潮暴 发早期单细胞球形棕囊藻的方法， 最低定量限可 达到32个单细胞， 并且定量分析了实际环 境样本 中较低丰度的单细胞球形棕囊藻， 能准确实现球 形棕囊藻赤潮暴发早期低丰度的单细胞棕囊藻 定量分析。 权利要求书2页 说明书10页 附图4页 CN 114574623 A 2022.06.03 CN 114574623 A 1.一种定量分析赤潮暴发早期单细胞球形棕囊藻的方法， 其特征在于： 包括以下操作 步骤： (1)引物和探针的设计与合成： 在球形棕囊藻核糖体基因5.8S ‑ITS2区域的保守区域设计与合成引物和探针， 设计与 合成引物序列为： 上游引物序列PGf2： 5' ‑ATGGCATTTCCAAGTTTCGC ‑3'， 退火温度58.6℃； 下游引物序列 PGf2： 5'‑GCACTCCCCAGCTTCAGC ‑3'， 退火温度58.1℃； TaqMan探针的序列PGp2： 5' ‑FAM‑ CGTCTGAACCTCCTCCA‑NFQ‑MGB‑3'， 退火温度68℃； (2)样品基因DNA提取： 采用天根植物基因组DNA提取试剂盒进行提取， 提取出样品基因 的核酸溶 液； (3)采用步骤(1 )中的引物和探针配置荧光定量PCR定量体系， 并进行荧光定量PCR检 测； (4)采用步骤(2)提取的实际环境样本的核酸溶液与球形棕囊藻阳性对照样品的荧光 定量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序比对分析， 以确定方法的特异性以及对实际环境 样本中单细胞球形棕囊藻定量的可 行性。 (5)单细胞球形棕囊藻定量： 取待测样品通过流式细胞仪准确计数， 之后按步骤(2)提 取核酸溶液， 稀释后按步骤(3)对 各数量级的样品进 行定量体系的配置和上机检测， 其中扩 增曲线的阈值设定在 扩增曲线的指数期， 所设置的阈值＝0.105， 阈值与扩增曲线相交 时的 值为Ct值， 根据各个数量级的细胞和其所测得的Ct值之间的关系建立标准曲线， 得到定量 方程式， 以此 方程式计算出球形棕囊藻单细胞的数量。 2.根据权利要求1所述的一种定量分析赤潮暴发早期单细胞球形棕囊藻的方法， 其特 征在于： 在步骤(1)中， 所述引物序列中， FAM为标记在探针5'端的报告荧光集团， NFQ为标记 在探针3'末端的非荧 光淬灭集团， MGB为标记在3'端的DNA小沟结合物。 3.根据权利要求1所述的一种定量分析赤潮暴发早期单细胞球形棕囊藻的方法， 其特 征在于： 在步骤(1)中， 所述的上、 下游引物的荧 光定量PCR产物片段 大小为147bp。 4.根据权利要求1所述的一种定量分析赤潮暴发早期单细胞球形棕囊藻的方法， 其特 征在于： 在步骤(2)中， 采用天根植物基因组DNA提取试剂盒进行提取时的操作步骤参照试 剂中说明书的方法进行， 最终提取后核酸溶 液的体积为5 0‑100uL。 5.根据权利要求1所述的一种定量分析赤潮暴发早期单细胞球形棕囊藻的方法， 其特 征在于： 在步骤(3)中， 荧光定量PCR分析的反应体系包括： 2 ×GoldStar  probe Mixture、 上 游引物PGf2、 下游引物PGf2、 探针PGp2、 DNA模板、 5 0×Low ROX、 ddH2O。 6.根据权利要求1所述的一种定量分析赤潮暴发早期单细胞球形棕囊藻的方法， 其特 征在于： 在步骤(3)中， 荧 光定量PCR分析的反应 体系为20uL。 7.根据权利要求1所述的一种定量分析赤潮暴发早期单细胞球形棕囊藻的方法， 其特 征在于： 在步骤(3)中， 荧光定量PCR检测的反应程序采用两步法， 即95℃预变性10min， 95℃ 变性15s， 6 0℃退火延伸6 0s， 此处采集 荧光信号， 共计40个 循环。 8.根据权利要求1所述的一种定量分析赤潮暴发早期单细胞球形棕囊藻的方法， 其特 征在于： 在步骤(4)中， 步骤(2)中的核酸溶液与阳性对照样品的荧光定量P CR产物片段大小 与所设计引物与探针时的预计产 物片段大小一致； 进 行二代测序后通过比对和构建进化树权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114574623 A 2分析， 可确定特异性扩增信号的生物就是球形棕囊藻。 9.根据权利要求1所述的一种定量分析赤潮暴发早期单细胞球形棕囊藻的方法， 其特 征在于： 在步骤(5)中， 单细胞球形棕囊藻的定量方程式为： Y＝ ‑3.305x+34.07， 线性关系R2 ＝0.999。 10.一种包 含权利要求1中所述的引物和探针的试剂盒。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114574623 A 3