(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210359342.7 (22)申请日 2022.04.07 (71)申请人 西北大学 地址 710069 陕西省西安市碑林区太白北 路229号 申请人 北京勤邦生物技 术有限公司 (72)发明人 牛晨　岳田利　宋玺英　盛庆林　 张瑜　吴小胜　凡静静　 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/38(2006.01) (54)发明名称 一种检测椰毒假单胞菌的重组酶聚合酶恒 温扩增方法、 其引物探 针组合物及用途 (57)摘要 本发明公开了一种检测椰毒假单胞菌的重 组酶聚合 酶恒温扩增方法、 其引物探针组合物及 用途。 本发 明所提供的引物探针组合物由正向引 物、 反向引物和探针组成， 所述正向引物具有如 SEQ ID No.1所示的核苷酸序列， 所述反向引 物 具有如SEQ  ID No.2所示的核苷酸序列， 所述探 针具有如SEQ  ID No.3所示的核苷酸序列。 本发 明还提供了一种检测椰毒假单胞菌的重组酶聚 合酶恒温扩增方法。 本发明首次采用重组酶聚合 酶恒温扩增技术结合侧向层析技术建立快速检 测椰毒假单胞菌的方法， 具有操作简单、 灵敏度 高、 特异性强、 反应结果易于观察、 安全 无污染等 特点， 非常适用于食品安全现场检测及监控。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 CN 114672579 A 2022.06.28 CN 114672579 A 1.一种检测椰毒假单胞菌的引物探针组合物， 其特征在于， 所述引物探针组合物由正 向引物、 反向引物和探针组成， 所述正向引物具有如SEQ  ID No.1所示的核苷酸序列， 所述 反向引物具有如SEQ  ID No.2所示的核苷 酸序列， 所述探针具有如SEQ  ID No.3所示的核苷 酸序列。 2.根据权利要求1所述的引物探针组合物， 其特征在于， 所述反向引物的5 ’端标记生物 素Biotin； 所述探针的5 ’端标记羧基荧光素FAM， 且在距羧基荧光基团40个碱基处增加一个 四氢呋喃THF， 3 ’端由C3spacer修饰。 3.权利要求1 ‑2任一所述的引物探针组合物在检测椰毒假单 胞菌中的应用。 4.一种检测椰毒假单胞菌的重组酶聚合酶恒温扩增方法， 其特征在于， 以待测样品的 基因组DNA为反应模板， 采用权利要求 1‑2任一所述的引物探针组合物进 行重组酶聚合酶扩 增， 然后使用侧向层析核酸检测试纸条检测扩增产 物， 判断检测结果， 当检测线和质控线 上 都出现红色条 带时， 表示待测病菌为椰毒假单 胞菌。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114672579 A 2一种检测椰毒假单胞菌的重组酶聚合酶恒 温扩增方 法、 其引 物探针组合物及用途 技术领域 [0001]本发明涉及椰毒假单胞菌的检测， 具体涉及一种检测椰毒假单胞菌的重组酶聚合 酶恒温 扩增方法、 其引物探针组合物及用途。 技术背景 [0002]椰毒假单胞菌属于革兰氏阴性菌， 易在食品表面生长， 容易污染谷类发酵制品(发 酵玉 米面、 糯玉米汤圆粉、 发酵糯小米等)、 薯类制品(马铃薯粉条、 甘薯淀粉、 山芋淀粉等) 及 变质银耳和木耳等。 椰毒假单胞菌引起的食物中毒 具有极高的致死率， 对健康造成严重 威胁， 由该菌引发食物中毒的平均死亡率可达41.8 ％。 因此， 对椰毒假单胞菌进行快速灵 敏检测是  保证食品安全和人们身体健康的有效措施。 [0003]目前， 检测食品中的椰毒假单胞菌 的方法主要有传统培养法、 快速检测 法和分子 检测法。 其中， 传统培养法检测是国际通用认可的方法， 准确性高， 但培养过程周期长， 易 受环境及  人为因素的影响， 而且生化实验繁琐， 不能实现批量产品快速检测； 快速检测法 是利用全自  动微生物生化鉴定和基因指纹鉴定仪对椰毒假单胞菌进 行鉴定， 方便快速、 特 异性强、 灵敏  度高， 但存在检测出假阳性的风险； 分子检测法是基于保守序列16S  rRNA、 23S rRNA以及  16S～23S  rRNA间区序列， 利用PCR(聚合酶链式反应)、 产物测序分析及脉冲 场凝胶电泳等  技术建立的一种检测方法， 但是这些检测 技术大多需要依赖后续的电泳过 程， 操作过程相对  繁琐， 对检测人员有较高的技术要求， 而且大多需要昂贵的仪器设备， 所 以也不适合现场快 速检测。 因此急需开发新的快速简单灵敏的椰毒假单 胞菌检测方法。 [0004]重组酶聚合酶扩增(Recombinase  polymerase  amplification， RPA)是2006年由 英国公司  TwistDx Inc研发的一种核酸恒温扩增技术。 该技术能够在15min内进行常温下 的单分子核酸  检测， 对硬件设备的要求很低， 反应时间短， 无需对样品进 行复杂处理， 且扩 增产物可通过  侧向层析试纸条实现可视化判别， 特别适合用于体外诊断、 兽医、 食品安全、 生物安全、 农  业等。 [0005]本发明采用重组酶聚合酶恒温扩增技术结合侧向层析技术建立快速检测椰毒假 单胞菌的 方法， 通过检索， 尚未发现与本发明申请相关的专利公开文献。 发明内容 [0006]本发明的目的在于克服现有技术的不足之处， 提供一种检测椰毒假单胞菌的重组 酶聚合 酶恒温扩增方法、 其引物探针组合物及用途， 该方法具有高灵敏度、 高特异 性、 可视 化、 操 作简单、 便携的特点。 [0007]本发明是通过以下技 术方案实现上述的发明目的： [0008]一种检测椰毒假单胞菌 的引物探针组合物， 该引 物探针组合物由正向引 物、 反向 引物和 探针组成， 所述正向引物具有如SEQ  ID No.1所示的核苷酸序列， 所述反向引物具 有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列， 所述探针具有如SEQ  ID No.3所示的核苷酸序列。说　明　书 1/4 页 3 CN 114672579 A 3