(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210372220.1 (22)申请日 2022.04.11 (71)申请人 中国计量科 学研究院 地址 100029 北京市朝阳区北三环东路18 号 (72)发明人 牛春艳　戴新华　董莲华　王霞　 高运华　 (74)专利代理 机构 北京知文通达知识产权代理 事务所(普通 合伙) 16051 专利代理师 欧阳石文 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 30/86(2006.01)G01N 21/33(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种用于 评估逆转录效率的方法及其应用 (57)摘要 本发明提供了一种用于评估逆转录效率的 方法。 对所建立的或所使用的逆转录 ‑PCR定量方 法的逆转录效率， 提出一套基于同位素稀释质谱 法的高准确度逆转录效率评估 方案。 首先通过逆 转录数字PCR对目的基因的RNA进行拷贝数浓度 的测定， 再进一步通过同位素稀释质谱法来测定 该目的基因的RNA拷贝数浓度， 计算获得的两种 RNA拷贝数浓度的比值， 从而获得相应的逆转录 体系的逆转录效率。 通过对逆转录效率准确评 估， 修正逆转录PCR结果， 从而获得目标RNA分子 的准确含量， 满足不同领域对RNA分子准确定值 的需求。 权利要求书2页 说明书9页 序列表3页 附图2页 CN 114657235 A 2022.06.24 CN 114657235 A 1.一种用于 评估逆转录效率的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： （1） 针对目的基因序列设计并体外转录获得RNA； （2） 将步骤 （1） 的RNA稀释后作为模板进行逆转录数字PCR反应； （3） 通过步骤 （2） 中的逆转录数字PCR反应的结果进一步计算获得逆转录的模板RNA的 拷贝数浓度， 并通过步骤 （2） 中的稀释的倍数计算稀释前的RNA拷贝数浓度为 n1； （4） 采用同位素稀释质谱法检测步骤 （1） 中的转录RNA的拷贝数浓度为 n2； （5） 计算 步骤 （2） 中所述逆转录的效率 为A=n1/n2×100%。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于： 所述步骤 （4） 中同位素稀释质谱法的操作为： ①RNA分子酶切， 在酶切体系中加入体外转录的RNA分子及同位素内标； ②配制核苷酸标准溶 液； ③液质联用仪分析， 将酶切后的RNA分子溶液及核苷酸标准溶液分别经液质联用仪分 析， 记录每种溶 液中四种核苷酸及核苷酸内标的峰面积； 核苷酸质量浓度计算。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于： 所述 步骤 （1） 中RNA浓度为0.1~10 μg/g。 4.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述配置核苷酸标准溶液为： 利用紫外分 光光度法测量体外转录RNA分子溶液 的估算浓度， 根据分子量及其分子组成估算四种核苷 酸的浓度； 配制两个浓度的标准溶液， 高标溶液及低标溶液， 在标准溶液中加入已知纯度的 四种核苷酸标准物质， 以及四种核苷 酸内标， 在加入各个组分的过程中， 通过天平称量记录 各组分的质量； 两个标准溶液中， 同位素核苷 酸内标的浓度均与体外转录RNA分子中核苷 酸 浓度接近1： 1， 高标溶液中， 核苷酸浓度大于同位素内标浓度， 低标溶液中， 核苷 酸浓度小于 同位素内标浓度。 5.根据权利要求 4所述的方法， 其特 征在于， 所述核苷酸质量浓度计算采用如下公式： 式中：Wx‑‑核苷酸质量浓度， μg/g； P——核苷酸标准物质纯度， %； D——稀释倍数； Ws——样品中同位素内标的质量浓度， μg/g ； Ix——样品中核苷酸与同位素内标的峰面积比； W1——高标溶液核苷酸与同位素内标的质量浓度比； W2——低标溶液核苷酸与同位素内标的质量浓度比； I1——高标溶液核苷酸与同位素内标的峰面积比； I2——低标溶液核苷酸与同位素内标的峰面积比。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 按公式 （2） 计算RNA分子质量浓度， （2）权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114657235 A 2式中： WRNA‑‑RNA分子质量浓度， μg/g； MRNA‑‑RNA分子相对分子质量； MNMP——所选核苷酸的相对分子质量； N‑‑RNA分子中所选核苷酸的数量。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 按公式 （3） 计算RNA拷贝数浓度， （3） 式中：n2‑‑RNA分子拷贝数浓度， copies/ μL； NA——阿伏伽德罗常数。 8.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述目的基因为 新型冠状病毒基因。 9.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中的逆转录是不同逆转录酶、 逆转录引物种类或浓度的优化， 或者逆转录温度的优化条件的逆转录 。 10.根据权利要求1至9任一项所述的方法在评估不同逆转录酶逆转录效率、 逆转录中 引物种类或浓度的优化， 或逆转录中反应温度的优化中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114657235 A 3