(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210561529.5 (22)申请日 2022.05.23 (71)申请人 江西师范大学 地址 330022 江西省南昌市紫阳 大道99号 (72)发明人 戴嘉文　方莹　徐莲莲　黎泓波　 (74)专利代理 机构 郑州优盾知识产权代理有限 公司 41125 专利代理师 冉珊敏 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/682(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 基于λ核酸外切酶选择性消化实现的急性 白血病Pax- 5a基因检测试剂盒及其使用方法 (57)摘要 本发明属于生物分析领域， 涉及基于 λ核酸 外切酶选择性消化实现的急性白血病基因Pax ‑ 5a基因检测试剂盒。 在目标基因存在的时候， HP ‑ HCR的尾部序列与Pax ‑5a基因形成平末端。 加入 λ核酸外切酶后， 从5 ’端开始逐渐消化发夹， 将 Pax‑5a序列从HP ‑HCR上释放出来与下一个发夹 探针结合， 实现基因的循环利用， 达到第一步扩 增的目的。 同时， HP ‑HCR被裂解成单链 触发链， 引 发杂交链式反应。 H1链被触发链打开后， 与H2链 序列杂交。 产生的杂交链继续与新的H1和H2链结 合， H1和H2上的荧光基团与猝灭基团相互远离， 荧光信号恢复以实现Pax ‑5a基因的第二次扩增。 从而实现对急性白血病Pax ‑5a基因的检测。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 114921547 A 2022.08.19 CN 114921547 A 1.基于λ核酸外切酶选择性消化实现的急性白血病Pax ‑5a基因检测试剂盒， 其特征在 于： 包括HP ‑HCR链、 H1链、 H2 链、 缓冲液体系和 λ核酸外切酶。 2.根据权利 要求1所述的急性白血病Pax ‑5a基因检测试剂盒， 其特征在于： 所述HP ‑HCR 链序列为5 ’ ‑ACTGAGTCTCCCCATGCCTGAGAGATGCGGTGATCCTTGA GACTTCAGATCTCAAGGATCACCGC ATCTCTCA ‑3’、 H1链序列为5 ’ ‑TGAGAGATGCGGT ‑FAM‑GATCCTTGAGACTAAGTTCTCAAGGAT ‑BHQ‑ CACCGCAT ‑3’、 H2链序列为5 ’ ‑TCTCAAGGAT ‑FAM‑CACCGCATCTCTCAATGCGGT ‑BHQ‑ GATCCTTGAGAACTTAG‑3’。 3.根据权利要求2所述的急性白血病Pax ‑5a 基因检测试剂盒， 其特征在于： 所述缓冲 液体系为pH=7.9的1   × NEB Buffer2， 其中含有100  mM Tris HCl、 100 mM MgCl2、 10 mM  dithiothreito l、 500 mM NaCl。 4.权利要求3所述的急性白血病Pax ‑5a基因检测试剂盒的使用方法， 其特征在于， 步骤 如下： （1） 配制HP ‑HCR链溶液， 然后与待测溶液混合后， 加入缓冲液体系， 37℃孵育1小时得反 应体系； （2） 向步骤 （1） 的反应体系中加入1  μL λ核酸外切酶， 37℃孵育15分钟， 然后加热使酶 失活； （3） 经步骤 （2） 处理后的反应体系冷却至室温后， 再加入H1、 H2链溶液， 37℃孵育75分 钟， 经荧光光度计收集 荧光信号， 代入线性方程计算得待测溶 液的浓度。 5.根据权利要求4所述的急性白血病Pax ‑5a 基因检测方法， 其特征在于： 所述步骤 （1） 中HP‑HCR链的浓度为10  μM。 6.根据权利要求4所述的急性白血病Pax ‑5a基因检测方法， 其特征在于： 所述步骤 （2） 中λ核酸外切酶的浓度为5 00 U/mL。 7.根据权利要求4所述的急性白血病Pax ‑5a基因检测方法， 其特征在于： 所述步骤 （3） 中H1链溶 液和H2链溶液的浓度均为10  μM， H1链溶 液和H2链溶液的加入量均为1 μL。 8.根据权利要求4所述的急性白血病Pax ‑5a基因检测方法， 其特征在于： 所述步骤 （4） 中收集荧光信号时采用的激发波长为492  nm， 发射波长的检测范围为490  nm‑650 nm， 扫描 速度为120 0 nm/min。 9.根据权利要求4所述的急性白血病Pax ‑5a基因检测方法， 其特征在于： 所述步骤 （4） 中线性方程为分段式方程， 当荧光信号为5000 ‑7000 a.u.时， 线性方程为y=910.06lg(x)+ 6674.3， R2=0.99352； 当荧光信号为 （1 ‑6）×104 a.u.时， 线性方程为y=22034.7096lg(x)+ 8492.9880， R2=0.9936。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114921547 A 2基于λ核酸外切酶选择性消 化实现的急性白血病Pax ‑5a基因 检测试剂盒及其使用方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物分析领域， 涉及基于λ核酸外切酶选择性消化实现的急性白血病 Pax‑5a基因检测试剂盒及其使用方法。 背景技术 [0002]急性B淋巴细胞白血病是一种可怕的癌症， 尤其是在儿童中。 急性白血病的主要特 征表现为细胞分化和增殖的遗传变化或染色体异常。 Pax ‑5通常是指Pax ‑5a， Pax‑5基因在 调节B细胞的发育和分化中起重要作用， 是Pax家族的成员中的一员。 Pax ‑5基因的异常表达 与淋巴细胞白血病密切相关。 它在其他谱系的肿瘤中很少呈阳性， 因此Pax ‑5被认为是B细 胞谱系的标志物。 因此， 研究和检测Pax ‑5基因对于急性B淋巴细胞白血病的早期诊断和晚 期治疗具有重要意 义。 [0003]λ核酸外切酶是一种外切酶， 可以消化磷酸化的双链D NA和单链D NA。 反应机理是沿 5’ ‑3’序列逐渐降解磷酸化的单核苷酸5 ’端。 λ核酸外切酶具有高剪切速率， 但对非磷酸化 DNA和单链DNA的活性较低。 鉴于此特性， λ核酸外切酶可用于切割磷酸化双链DNA以获得所 需的单链DNA。 [0004]为了提高检测核酸时信号的灵敏度， 往往需要构建信号放大系统。 研究人员提出 了许多用于放大生物信号的技术， 例如CRISPR ‑Cas13a放大系统、 解旋酶连接的放大系统、 聚合酶链式反应(PCR)和杂交链式反应(HCR)。 本课题组前期对急性白血病 基因Pax5a检测 采用了电化学法对信号进 行放大， 通过DNA聚合 酶和限制性内切酶两种酶的相互协同作用， 实现了目标基因的循  环利用， 放大了检测信号； 酶促扩增产生的G ‑四链体可以与hemin结 合形成具有辣根过氧化  物模拟酶性质的G ‑四链体/hemin复合物， 利用其催化双氧水的还 原产生的稳定的电流信  号， 实现了对目标基因的灵敏检测； 然而， 电化学生物传感器通常 在信号产生方面具有某些限制 。 一方面， 在构建电化  学生物传感器时， 需要标记适当的电 活性物质， 这可能会限制检测灵敏度； 第二方面， 一般  电化学层层组装反应会在电极表面 不断引入干扰物； 第三方面， 直接在电极 界面将适当的  信号放大技术引入电化学生物传感 器的构建是存在 效率问题。 因此， 在电极表面上开发新  型信号放大策略、 抗干扰及信号放 大效率等以提高分析物检测灵敏度为指标方法对于扩大  电化学分析应用和性能具有重要 意义。 发明内容 [0005]为解决上述问题， 本发明提出一种基于λ核酸外切酶选择性消化实现的急性白血 病Pax‑5a基因检测试剂盒及其使用方法。 [0006]本发明的技 术方案是这样实现的： 基于λ核酸外切酶选择性消化实现的急性白血病Pax ‑5a基因检测试剂盒， 包括HP ‑ HCR链、 H1链、 H2 链、 缓冲液体系和 λ核酸外切酶。说　明　书 1/4 页 3 CN 114921547 A 3