ICS 65.020.30 CCS B 41 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 5345—2021 猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒 2 型二重 PCR 检测方法 2021 - 01 - 21 发布 河北省市场监督管理局 2021 - 02 - 21 实施 发 布 DB13/T 5345—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第一部分：标准化文件的结构与起草规则》的规定 起草。 本文件由河北农业大学提出。 本文件起草单位：河北农业大学。 本文件主要起草人：袁万哲、赵款、张建虹、王建昌、韩荞忆、李丽敏、宋勤叶、董世山、李希 明、张磊、李睿文、白云、郝雪飘。 I DB13/T 5345—2021 猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒 2 型二重 PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型二重PCR检测方法的技术要求。 本文件适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型的同时检测。 2 规范性应用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试剂材料 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 病毒核酸提取试剂盒。 1.0%琼脂糖凝胶，配制方法见附录 A 中 A.1。 50×TAE 缓冲液，配制方法见附录 A 中 A.2。 溴化乙锭（EB，10 ug/μ L）或市售核酸染料，配制方法见附录 A 中 A.3。 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌双蒸水，配制方法见附录 A 中 A.4。 DNA 分子量标准（100 bp）。 反转录酶。M-MLV 反转录酶（200 U/μ L）或 AMV 反转录酶（10 U/μ L） RNA 酶抑制剂。 2×Taq MasterMix。含有 PCR 缓冲液、酶混合物、dNTP 混合物、无 RNA 酶的水等。 dNTP。浓度为 2.5 mM。 引物。反转录引物、上游引物与下游引物见附录 B 中的表 B.1。引物浓度为 10 μ mol/L。 5 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 PCR 仪。 凝胶成像系统。 台式低温高速离心机。 电泳仪。 电泳槽。 冰箱。 1 DB13/T 5345—2021 5.7 微量移液器。单道可调；量程包括 0.5 μ L～10 μ L、2 μ L～20μ L、10 μ L～100μ L、100μ L～ 1000 μ L。 5.8 水浴锅。 6 样品 6.1 阴阳性对照 以灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型细胞培养物或者感染猪组织作为阳性对照，以 正常细胞或者是正常猪组织作为阴性对照。对照均应在-20 ℃保存。 6.2 样品的采集与处理 6.2.1 采集工具 下列采集工具应进行灭菌处理： a) 棉拭子； b) 剪刀； c) 镊子； d) 1.5 mL 离心管； e) 研钵； f) 一次性无菌采样袋。 6.2.2 棉拭子采集 将棉拭子深入鼻腔转一圈；将采集后的棉拭子放入盛有1.0 mL PBS（配制方法见附录A中A.5）的 1.5 mL离心管，编号。 6.2.3 血液采集 使用一次性注射器或采血管通过耳静脉或前腔静脉采血3 mL～5 mL，编号。 6.2.4 组织采集 剖检生猪，用剪刀采集肺、脾、肾、淋巴结等组织，装入一次性无菌采样袋，编号。 6.2.5 样品储运 样品采集后放入塑料袋内密封（一个采集点的样品放一个塑料袋内），样品的储存应按照NY/T 541 中条款7.1执行；样品的运输应按照NY/T 541中条款9执行。 6.2.6 样品的处理 6.2.6.1 棉拭子 将装有棉拭子的离心管在混合器上充分混合后，用高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出，4 ℃条 件下3000 r/min离心15 min，取上清液转入无菌的1.5 mL离心管中，编号备用。 6.2.6.2 血液 2 DB13/T 5345—2021 待血液凝固后，4 ℃条件下5000 r/min离心10 min取上清液转入无菌的1.5 mL离心管中，编号备 用。 6.2.6.3 组织 将所采集的组织置于洁净、灭菌并烘干的搪瓷盘中，称取组织按照质量体积比（1:5）加入样品保 存液进行充分研磨，4 ℃条件下3000 r/min离心15 min。取上清转入无菌的1.5 mL的离心管备用，编 号。 7 PCR 检测 7.1 核酸提取 使用商品化病毒核酸提取试剂，按照说明书进行操作。同时进行阴阳对照样品核酸的提取。 7.2 反转录 取6.1所得的核酸 11 μL，加入2 μL 10 µmol//L的反转录引物（PRRSV-decR）、4 μL 5×反转录缓 冲液、0.5 μL反转录酶、0.5 μL RNA酶抑制剂、2 μL dNTP Mixture，42 ℃水浴1 h，即得到cDNA溶液， 直接用于后续的PCR扩增或-20 ℃保存备用。 7.3 PCR 反应 在反应管中依次加入6 μL无核酸酶水、10 μL 2×Taq MasterMix、1 μL5.2.1的cDNA溶液、1 μL 6.1 中提取核酸、各0.5 μL 10µmol/L的上游引物（PRRSV-decF与PCV2-decF）、各0.5 μL 10 µmol/L的下 游引物（PRRSV-decR与PCV2-decR）。经充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底。 PCR扩增条件：94 ℃ 3 min，1个循环；94 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 27 s，30个循环；72 ℃ 5 min， 1个循环。扩增反应结束后立即进行电泳或置于4 ℃条件下备用。 7.4 扩增产物的电泳检测 在电泳槽内加入1×TAE电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取3 μL～5 μL扩增产物加到凝胶孔， 加入DNA分子量标准（100 bp）。恒压（110V）电泳30 min～40 min，在凝胶成像系统中观察结果。 8 结果判定 8.1 成立条件 阳性对照的扩增产物经电泳检测，在440 bp和321 bp位置均出现特异性的条带；阴性对照的扩增产 物在440 bp和321 bp位置没有特异性的条带。阴阳性对照同时成立表明试验有效，否则试验无效。在试 验成立的条件下进行结果判定。PCR产物电泳图见附录C中C.1。 8.2 结果描述及判定 8.2.1 如果样品的 PCR 产物电泳后仅在 321 bp 位置出现特异性的条带，则判定为猪繁殖与呼吸综合 征病毒核酸检测阳性。 8.2.2 如果样品的 PCR 产物电泳后仅在 440 bp 位置出现特异性的条带，则判定为猪圆环病毒 2 型核 酸检测阳性。 3 DB13/T 5345—2021 8.2.3 如果样品的 PCR 产物电泳后在 440 bp 和 321 bp 位置均出现特异性的条带，则判定为猪繁殖与 呼吸综合征病毒和猪圆环病毒 2 型核酸检测双阳性。 8.2.4 如果样品的 PCR 产物电泳后在 440 bp 和 321 bp 位置均未出现特异性的条带，则判定为猪繁殖 与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒 2 型核酸检测双阴性。 4 DB13/T 5345—2021 AA 附 录 A （规范性） 相关试剂的配制 A.1 1.0%琼脂糖凝胶 称取琼脂糖1.0 g，放入100 mL 1×TAE电泳缓冲液中，加热融化，温度降至60 ℃时，加入5 μL核 酸染料，均匀铺板，厚度为3 mm～5 mm。 A.2 50×TAE电泳缓冲液 A.2.1 0.5 mol/L EDTA溶液（pH 8.0） 称取EDTA 18.61 g，加灭菌双蒸水至100 mL，后用氢氧化钠调pH至8.0。 A.2.2 TAE电泳缓冲液（50×） Tris 242 g，冰乙酸57.1 mL，0.5 mol/L EDTA 100 mL，加灭菌双蒸水至1000 mL。 A.2.3 TAE电泳缓冲液（1×） 取50×TAE电泳缓冲液 100 mL，加灭菌双蒸水至5000 mL。 A.3 溴化乙锭（EB）溶液 溴化乙锭20 mg，加灭菌双蒸水至20 mL。 A.4 DEPC水 焦碳酸二乙酯（DEPC）50 μL，加灭菌双蒸水至100 mL，室温放置6 h～8 h，121 ℃±2 ℃高压灭菌 20 min，分装到1.5 mL DEPC处理过的离心管。 A.5 PBS缓冲液 A.5.1 A液（0.2 mol/L磷酸二氢钠水溶液） NaH2PO4·H2O 27.6 g先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至1000 mL。 A.5.2 B液（0.2 mol/L 磷酸氢二钠水溶液） Na2HPO4·7H2O 53.6 g，（或Na2HPO4·12H2O 71.6 g或Na2HPO4·2H2O 35.6 g）先用适量蒸馏水溶解， 最后用蒸馏水稀释至1000 mL。 A.5.3 0.01 mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液的配制 A液14 mL，B液36 mL，加氯化钠（NaCl）8.5 g，最后用蒸馏水稀释至1000 mL。 5 DB13/T 5345—2021 BB 附 录 B （规范性） 引物 B.1 表B.1 规定了引物的浓度和序列。 表 B.1 引物的浓度和序列 引物名称 6 引物浓度 PRRSV-decF 10 μ mol/L PRRSV-decR 10 μ mol/L PCV2-decF 10 μ mol/L PCV2-decR 10 μ mol/L 序列（5'- 3'） CAA ATA ACA ACG GCA AGC AG GCG TAG GCA AAC TAA ACT CCA CGG ATA TTG TAT TCC TGG TCG GCG GTG ATG ATG AGA TT DB13/T 5345—2021 CC 附 录 C （规范性） 猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒 2 型 PCR 产物电泳图 M 1 2 3 4 bp 500 250 说明： M——DNA 分子量标准（100bp） ； 1——猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒 2 型双阳性对照； 2——猪繁殖与呼吸综合征阳性对照； 3——猪圆环病毒 2 型阳性对照； 4——阴性对照。 图 C.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒 2 型 PCR 产物电泳图 _________________________________ 7