ICS11.020 CCS C 59 DB65 新疆维吾尔自治区地方标准 DB 65/T 4679—2023 脊髓灰质炎病毒型内鉴定规程 Code of practice for intratypic differentiation of poliovirus 地方标准信息服务平 2023-09-20实施 2023 -07- 20 发布 发布 新疆维吾尔自治区市场监督管理局 地方标准信息服务平台 DB 65/T 4679—2023 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心提出。 本文件由新疆维吾尔自治区卫生健康委员会归口。 本文件起草单位：新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心、新疆维吾尔自治区标准化研究院。 本文件主要起草人：唐海淑、凯赛尔·吾斯曼、王琪、宁静、朱帕尔古丽·哈那西、周洁、艾克达·阿 不都热依木、翟啸虎、沙吾拉西·热加甫、朱芸、王唯佳。 本文件实施应用中的疑问，请咨询新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心。 对本文件的修改意见建议，请反馈至新疆维吾尔自治区卫生健康委员会（乌鲁木齐市天山区龙泉街 191号）、新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心（新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市天山区碱泉一街380号） 新疆维吾尔自治区市场监督管理局（乌鲁木齐市新华南路167号）。 新疆维吾尔自治区卫生健康委员会联系电话：0991-8561122；传真：0991-8561122；邮编：830000 新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心联系电话：0991-2625962；传真：0991-2625962；邮编： 830000 新疆维吾尔自治区市场监督管理局联系电话：0991-2817197；传真：0991-2311250；邮编：830000 地方标准信息服务平台 地方标准信息服务平台 DB 65/T 4679—2023 脊髓灰质炎病毒型内鉴定规程 1范围 本文件规定了脊髓灰质炎病毒（PolioVirus，PV）型内鉴定（IntratypicDifferentiation，ITD） 的规程，包括鉴定对象、鉴定来源、鉴定方法、96孔板的合理使用及布局简介、曲线阴性与阳性的判定、 最终结果表述规则与判定规则的技术要求。 本文件适用于对脊髓灰质炎病毒进行型内鉴定时开展的实验活动。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件： 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 WS/T294脊髓灰质炎诊断 3术语和定义 WS/T294界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 脊髓灰质炎病毒poliovirus 该病毒为小核糖核酸病毒科（Picornaviridae），肠道病毒属（Enterovirus），可分为I型、I 型、II型共3个血清型，各型间无交叉免疫。以下简称脊灰病毒。 [来源：WS/T294—2016，附录A.1] 3. 2 型内鉴定intratypic differentiation，ITD 对同一血清型的脊灰病毒，鉴定其为疫苗类似株、疫苗衍生脊灰病毒还是脊灰野病毒的方法。 3.3 疫苗类似株sabin Like，SL 与原始疫苗病毒Sabin株相比，I型和I型脊灰病毒VP1编码区核苷酸变异<9个，II型脊灰病毒VP1 编码区核苷酸变异<5个，则称为疫苗类似株。 3. 4 疫苗衍生脊灰病毒vaccunederivedpoliovirus，VDPV 与原始疫苗病毒Sabin株相比，I型和I型脊灰病毒VP1编码区核苷酸变异≥10个，且<135个（变 异率≥1%，且<15%）；II型脊灰病毒VP1编码区核苷酸变异≥6个,且<135个(变异率>0.6%,且< 15%），则称为疫苗衍生脊灰病毒。 [来源：WS/T294—2016，附录A.2] 3. 5 脊灰野病毒wildpoliovirus，WPV 1 DB65/T4679—2023 与原始疫苗病毒Sabin株相比，当脊灰病毒VP1编码区核苷酸变异≥135个（变异率≥15%），则称 为脊灰野病毒。 3. 6 疫苗衍生脊灰病毒筛查VDPVscreening 对鉴定为疫苗类似株的脊灰病毒进行进疫苗衍生脊灰病毒的筛查。 4鉴定规程 4.1鉴定对象 脊灰病毒。 4.2鉴定对象来源 急性弛缓性麻痹病例监测系统病例和接触者粪便标本、特定条件下采集的健康儿童粪便标本或外 环境污水标本。 4.3鉴定程序 脊灰病毒型内鉴定程序见图1。 非疫苗类似株 报告脊灰病毒血 清型并做测序 脊灰病毒细 进行血清型和 胞培养物 基因型鉴定 非疫苗类似株 报告脊灰病毒血 疫苗类似株 清型并做测序 做VDPV筛查 疫苗类似株 报告脊灰病毒血 清型 图1脊灰病毒型内鉴定程序 4.4鉴定方法 4.4.1脊髓灰质炎实验室网络进行脊灰病毒的型内鉴定多采用的是rRT-PCR方法。包括ITDrRT-PCR 和VDPVrRT-PCR，可对脊髓灰质炎病毒进行血清型和基因型的鉴定。 4.4.2根据两者检测的目的不同，设计了多套不同的引物（见附录A）和探针，每套引物和探针均高度 用于3种混合血清型病毒的同时检测，使用更加灵活，并且单独检测与同时检测效果没有显著差异。 务平台 4.4.3ITDrRT-PCR结果为疫苗类似株时，需要进行下一步的VDPV筛查。 596孔板的合理使用及布局简介 ITDrRT-PCR时，在96孔板上，第1、7列、2、8列、3、9列、4、10列、5、11列、6、12列分别做 Quadruplex（包含PanEV、SabinI、SabinII、SabinII）、PanPV、DuplexWPV1（含AFRWPV1和SOASWPV1）、 PV2、WPV3-1、WPV3-2引物和探针的鉴定，A1～A6为试剂盒阴性对照，B2～B6为试剂盒阳性对照，C1～ 2 DB 65/T4679—2023 C6为标本1，D1～D6为标本2…·依次类推，即每份标本要同时做6组（含10对）引物的鉴定，每块96孔 板可鉴定14份标本，96孔板的布局示意图见图2。 Duplex Wpvi PanpV Quadruplex 12 标本7 试剂盒阴性对照 标本8 试剂盒阳性对照 i标本9 标本1 >C 标本10 标本2 D 1标本11 标本3E 标本4 e> F 标本12 标本13 标本5G 标本14 标本6 PV2 WPV3-1 WPV3-2 图296孔板的布局示意图 696孔板的阴、阳性判定 6.1脊髓灰质炎病毒型内鉴定在荧光定量PCR系统上鉴定（仪器使用方法参照仪器使用说明书），试 剂配置方法和扩增条件按试剂盒说明书进行。待测反应孔检测结果若循环阈值(Cyclethreshold，Ct) ≤28，曲线呈S型且有明显指数增长期，则判断该孔为阳性（+）（阳性扩增曲线示意图见图3）。 标准信息服务平台 Ampliferalinn P'ha 20000. F50XX00 <10x00 0 10 13 20 25 30 :35 + 图3阳性（+）扩增曲线示意图