ICS 07.080 C40 CMBA 团体标准 T/CMBA 011—2020 人外周血 单个核细胞的采集、分离和保存 Collection, Separation and Preservation of PBMC from Human Peripheral Blood 2020 - 12 - 28发布 2020 - 12 - 28实施 中国医药生物技术协会 发布 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/CMBA 011—2020 I 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 总则 ............................................................................... 2 5 实验原理 ........................................................................... 2 6 实验方法 ........................................................................... 2 6.1 材料 ........................................................................... 2 6.2 步骤 ........................................................................... 3 7 质量控制 ........................................................................... 4 7.1 活细胞计数 ..................................................................... 4 7.2 RNA的质量控制 .................................................................. 5 7.3 DNA的质量控制 .................................................................. 5 参考文献 ............................................................................. 6 全国团体标准信息平台 T/CMBA 011—2020 II 前 言 本文件按 GB/T 1.1 -2020 给出的规则起草。 本文件由中国医药生物技术协会归口。 本文件起草单位：中国医药生物 技术协会组织生物样本库分会、生物芯片上海国家工程研究中心、 上海芯超生物科技有限公司、广州中医药大学第二附属医院（广东省中医院） 。 本文件主要起草人：郜恒骏 、沈晓莹、杜莉利、亓垚 、张小燕、许靖曼、陈明敏 、陈曲波、叶扬、 李迪。 全国团体标准信息平台 T/CMBA 011—2020 1 人外周血单个核细胞的采集、分离和保存 1 范围 本文件规定了采集、分离和保存 人外周血单个核细胞 的实验原理、实验 方法和质量控制。 本文件适用于科研用人 外周血单个核细胞 的采集、分离和保存 ，若用于临床，应按照临床相关要求 进行操作。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 38576- 2020 人类血液样本采集与处理 3 术语和定义 以下术语和定义适用于本文件。 3.1 外周血单个核细胞 Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC 外周血中具有单个核的细胞，包含淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和其他 少量细胞（造血干细胞 等）。 3.2 淋巴细胞分离液 Lymphocyte Separation Medium 一种密度介于 1.075 ~ 1.090 g/ml 之间而近似于等渗的溶液，用它做密度梯度离心，使一定密度的 细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以 分离。 3.3 RPMI-1640 培养基 RPMI-1640 Medium 洛斯维 •帕克纪念研究所 （Roswell Park Memorial Institute , RPMI）研发的一类细胞培养基， 1640 是 培养基代号。 3.4 二甲基亚砜 Dimethyl sulfoxide, DMSO 非质子极性溶剂，常用于化学反应、 PCR 反应以及在细胞、组织和器官的保存中用作玻璃化低温 冷冻防护剂。 DMSO 用于细胞冷冻培养基内，可以保护细胞免受冰晶引起的机械性损伤。它也可以用 全国团体标准信息平台 T/CMBA 011—2020 2 于主培养、亚培养、重组异倍体、杂交瘤等系列细胞株，胚胎干细胞（ESC ）和造血干细胞的冷冻保藏。 另外常常与 BSA 或 FBS 混合使用。 3.5 台盼蓝 Trypan Blue 也称台盼兰、锥虫蓝、曲利苯蓝， 细胞活性染料，常用于检测细胞膜的完整性，检测细胞是否存活。 活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。台盼蓝可被巨噬细胞吞噬，故可用于巨噬细胞的活 体染色剂。 3.6 知情同意 Informed Consent 供体对生物样本 （本文件中为“外周血”） 捐赠的目的和研究用途等明了和认可。以生物样本 供体 自愿同意参与为原则，以当事双方共同签署知情同意书为具体体现。 3.7 脱氧核糖核酸 Deoxyribonucleic Acid, DNA 染色体主要组成成分，同时也是主要遗传物质。 3.8 核糖核酸 Ribonucleic Acid, RNA 存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。 RNA 由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合 而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸 、核糖和碱基构成。 4 总则 本文件采用密度梯度离心 法进行人 PBMC 的分离，此方法适用范围广、性价比高、结果稳定。此 外还有加速红细胞沉降法、塑料吸附法、 Colotta 法、分离管法等。这些方法分离的 PBMC 应符合后续 实验要求。 5 实验原理 外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞 分离液作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按 相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分 离。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底； PBMC 的 比重小于或等于 分离液比重，离心后漂浮于 分离液的液面上，也有少部分细胞悬浮在 分离液中。吸取分 离液液面的细胞，就可从外周血中分离到 PBMC。 6 实验方法 6.1 材料 6.1.1 主要设备：生物安全柜、低温水平式离心机、血球计数板、显微镜、血细胞分离机等。 全国团体标准信息平台 T/CMBA 011—2020 3 6.1.2 主要耗材： 真空采血管（ACD/EDTA/ 肝素抗凝）、 离心管、移液管、 无菌吸头、冻存管、巴氏 吸管、移液器、辅助移液器、注射器、无菌棉球、镊子、橡皮止血带等。 6.1.3 主要试剂： RPMI -1640 培养基、胎牛血清、 DMSO、淋巴细胞分 离液（20 ℃ 时密度为 1.077 ± 0.001 g/ ml）、台盼蓝染色液、碘酒、 75％ 酒精等。 6.2 步骤 6.2.1 PBMC 的采集 6.2.1.1 获得供体知情同意后， 按照 GB/T 38576- 2020 常规无菌抽取新鲜外周血 至 ACD/EDTA/肝素 抗凝管中。 6.2.1.2 获得供体 知情同意后，使用血细胞分离机， 按照操作手册规范地采集；将采集到的血液或细 胞尽快分离 PBMC，在采集、处理和运输过程中避免冷冻和冷藏 。 6.2.2 PBMC的分离 6.2.2.1 分离前的准备：洁净实验室的常规消毒，紫外灯照射洁净间和生物安全柜，且保持台面的整 洁；准备好本次分离所需离心管、移液管、 无菌吸头 、冻存管、巴氏吸管、移液器、辅助移液器、注射 器、 RPMI -1640 培养基、胎牛血清、 DMSO、淋巴细胞分离液等。淋巴细胞分离