ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T562—2015 代替NY/T562—2002 动物衣原体病诊断技术 Diagnostic techniques for animal chlamydiosis 行业标准信息服务平台 2015-05-21发布 2015-08-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T562—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替NY/T562一2002《动物衣原体病诊断技术》。 本标准与NY/T562—2002相比，病原检测部分增加了血清学诊断技术和PCR诊断技术。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。 本标准主要起草人：周继章、曹小安、宫晓炜、陈启伟、郑福英、李兆才、邱昌庆、殷宏。 本标准的历次版本发布情况为： -NY/T562—2002。 行业标准信息服务平台 I NY/T562—2015 动物衣原体病诊断技术 1范围 本标准规定了动物衣原体鸡胚分离与传代培养技术、血清学诊断技术及PCR诊断技术。 本标准适用于实验室动物衣原体的分离、传代培养和动物衣原体病的诊断。其中，血清学直接补体 结合试验（DirectComplementFixationTest，DCF）适用于哺乳动物（猪除外）和鹦鹉、鸽（7岁以上老龄 鸽除外）衣原体病的诊断；间接补体结合试验（IndirectComplementFixationTest，ICF）适用于禽类（鹦 鹉、鸽除外，但包括老龄鸽）和猪衣原体病的诊断；间接血凝试验（IndirectHemagglutinationTest，IHA） 适用于动物衣原体病的产地检疫、疫情监测和流行病学调查；PCR诊断技术适用于牛、羊、猪和禽衣原 体病的诊断。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2. 1 工作量抗原workloadantigen 能发生完全反应的抗原量的单位，能与最高稀释度的血清呈现完全抑制溶血反应的最高抗原稀释 度即为1个工作量抗原的效价。 2. 2 指示血清serumdirected 与该抗原相应的哺乳动物抗血清。试验中测定的最高的标准血清稀释度即为1个工作量指示血清 的效价。 2. 3 补体结合试验conplementfixationtestCF 抗体与抗原反应形成复合物，通过激活补体而介导溶血反应，可作为反应强度的指示系统。以往多 用于病毒学检测。 2. 4 间接血凝试验indirecthemagglutinationtest,IHA 将抗原（或抗体）包被于红细胞表面，成为致敏的载体，然后与相应的抗体（或抗原）结合，从而使红 息服务平 细胞拉聚在一起，出现可见的凝集反应。 3动物衣原体的分离与培养 3.1试验材料 疑似或确定为衣原体感染的样本、鸡胚、孵化箱、无菌操作间、生物安全柜、冰箱、照蛋设备、鸡胚气 室开孔器、注射器、6号针头、离心机、碘酊、70%酒精、链霉素、卡那霉素、生理盐水等。 3.2材料要求 3.2.1样本采集 采集的样本应无杂菌污染，包括肝脏、脾脏、流产胎儿胃液、胎衣、流产分泌物等，其中流产胎儿的胃 液为首选样本。样品进行涂片姬姆萨染色（见附录A），油镜下观察疑似有衣原体染色颗粒（原生小体， EB)为紫红色，大小0.2μm~0.6μm;网状体(RB)为蓝黑色，直径为0.6μm～1.8μm。样本在室外或 1 NY/T562—2015 常温条件下放置时间不应超过72h，采集的样本应尽快放置于一20℃冰箱备用。如需较长时间保存，应 置于一80℃超低温冰箱。 3.2.2鸡胚要求 分离培养衣原体用的鸡胚最好为SPF受精鸡蛋孵育，或者受精鸡蛋至少应来自无衣原体抗体且不 使用氨芋类抗生素、四环素类抗生素、广谱抗菌抗病毒类药物的健康鸡群。 3.2.3环境要求 衣原体的分离培养应在实验室内进行，少量的接种分离培养在生物安全柜内操作即可。如果接种 鸡胚的数量较大，生物安全柜不能满足要求，应在无菌操作间内进行。鸡胚接种前后均在孵化箱内孵 育，保证相对稳定的发育温度和湿度。 3.3试验方法 3.3.1样本的处理 将镜检发现疑似衣原体颗粒，或确定为衣原体且无杂菌污染的液体样本用灭菌生理盐水1：4稀 释。如果是组织等样本，按体积大小用灭菌生理盐水1：4稀释后进行研磨破碎处理，3000r/min离心 20min，在4℃冰箱中稳定4h左右备用。对疑似污染的样本研磨粉碎后，用含链霉素（1mg/mL）和卡 那霉素（1mg/mL）的生理盐水1：4稀释，3000r/min离心20min，取其上清液以4000r/min~6000 r/min再离心，取上清液4℃冰箱稳定4h左右备用。 3.3.2鸡胚的准备 试验前7d，应将分离用的受精鸡蛋放入孵化箱孵育。弃去过大、过小、破壳、软壳、畸形壳蛋等，形 成7日龄发育的鸡胚。接种前1d，应弃去发育不良及死亡胚体，选择发育良好的鸡胚，划定气室及标记 发育体的位置以备用。 3.3.3鸡胚的接种 用碘酐消毒气室部位、开孔，孔大小以注射用针头进人为宜，接种深度为1.5cm～2.0cm。每个鸡 胚无菌操作接种0.4mL上述处理好的样本于卵黄囊内，蜡封蛋壳针孔，置于37℃～38.5℃孵化箱内 孵育。 3.3.4鸡胚卵黄囊膜的收集 弃去接种后72h内死亡的鸡胚，收集接种后4d～10d内死亡鸡胚卵黄囊膜继续传代，直至接种鸡 胚规律性死亡（即接种后4d～7d内死亡）。初次接种分离时，接种后10d内未死亡鸡胚，收集第10d 未死亡鸡胚卵黄囊膜，涂片姬姆萨染色。显微镜下观察疑似有衣原体染色颗粒，应将该卵黄囊膜继续传 代3代～4次。直至出现规律性死亡为止。继续传代时，将收集的鸡胚卵黄囊膜研磨破碎处理，加入生 理盐水稀释（1个卵黄囊膜加人4mL生理盐水）后，3000r/min离心20min，在4℃冰箱中稳定4h左右 后，接种7日龄发育良好的鸡胚传代。 3.4结果判定 初次分离时，传代鸡胚在接种后4d～7d内出现规律性死亡，可初步判定为衣原体感染，进一步的 确认需要进行细菌学检测和PCR鉴定。初次接种分离时，接种后10d内未死亡鸡胚，取卵黄囊膜涂片 染色，显微镜观察疑似有衣原体染色颗粒，应继续使用鸡胚传代3次～4次，仍然不死亡且显微镜检查 未发现疑似衣原体颗粒者，可判为衣原体感染阴性。 4动物衣原体病的PCR诊断 4.1试验材料 4.1.1仪器 PCR反应仪、低温高速离心机、稳压稳流电泳仪、紫外凝胶成像仪。 4.1.2试剂 2 NY/T 562—2015 TEbuffer、ProteinaseK、溶菌酶、TaqDNA聚合酶、SDS、饱和酚、无水乙醇、酚：氯仿：异戊醇 （25：24：1)、琼脂糖等。 4.1.3引物 登录Genbank，下载相关的基因序列，设计合成了2对引物。 第一对引物： MP1:5'-ATGAAAAAACTCTTGAAATCGG-3'; MP2:5'-TTAGAATCTGAATTGAGCATTCAT-3'。 第二对引物： MP3:5'-CAGGATACTACGGAGATTATGTTT-3'; MP4:5'-GATTAGATTGAGCGTATTGGAA-3′。 4.2方法 4.2.1衣原体基因组 DNA的提取 到1.5mL的Eppendorf管中。以10oμL的TE缓冲液冲洗勾浆器，冲洗液一并转人Eppendorf管中。 加人100μL20%的SDS（终浓度1%），混匀；加人ProteinaseK至终浓度为200μg/μL，混匀后60℃作 用30min。振摇混匀后转人37℃水浴2h，期间振摇数次。加人溶菌酶30μL，置于65℃水浴30min。 取出置沸水浴中5min。加人等体积的饱和酚，倒转混匀，4℃7500r/min离心10min，取上层水相，重 10min。转移上清液于另一离心管中。加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，一20℃沉淀30min，12000r/ min离心10min，弃去所有液相。用1mL70%乙醇漂洗2次～3次，每次12000r/min离心2min。真 空或室温干燥，DNA沉淀物用25μL无菌双蒸水溶解，保存在一20℃备用。 4.2.2PCR反应体系及条件 4.2.2.1推荐使用反应体系 第一次PCR扩增： 10XPCRbuffer(含Mg²+) 5 μL dNTPs 4 μL MP1和MP2引物 各 1μL 模板（被检样本总DNA） 4 μL 无菌双蒸水 34.75 μL Taq DNA 聚合酶 0. 25 μL 第二次PCR扩增： 10XPCRbuffer（含Mg2+） dNTPs 4μL MP3和MP4引物 各1μL 模板（一扩产物） 2 μL 无菌双蒸水 36.75 μL Taq DNA聚合酶 0. 25 μL 样本检测时，同时要设阳性对照和空白对照。阳性对照模板为衣原体MOMP基因阳性质粒，空白 对照为双蒸水，其他体系成分不变。如果是采用其他更好的反应体系时，可根据具体情况调整体系。 4.2.2.2反应条件 一扩：首先95℃充分变性5min；然后35个循环，分别为94℃变性1min、52.5℃退火1min、72℃延 伸2min；最后72℃延伸10min。 3 NY/T562—2015 二扩：35个循环，分别为94℃变性30s、51.6℃退火1min、72℃延伸2min；最后72℃延伸10min。 4.3电泳 4.3.1制板 取1g琼脂糖加入100mL电泳缓冲液，摇匀，加热溶化后制作1%琼脂糖凝胶板。 4.3.2加样 PCR反应结束，取二次扩增产物各5uL（包括被检样本、阳性